Explicacin de TP N 3

Reaccin en cadena de
la Polimerasa (PCR)

Qumica Biolgica
Patolgica
Bioq. Mariana L.
Ferramola
2012
 Definicin de PCR
Es la amplificacin enzimtica de un
fragmento de inters (DNA) localizado
entre dos oligonucletidos (cebadores).
Permite generar cantidades ilimitadas de
una secuencia de inters.
 Componentes del sistema de PCR

ADN molde
Oligonucletidos (cebadores o
primers)
Mste Polimerasa termoestable
r Mix
Solucin buffer
dNTPs (dATP; dCTP; dTTP;
dGTP)
 Componentes del sistema de PCR:
ADN molde
El ADN molde puede ser de cadena sencilla
o doble, circular o lineal. En caso de desear
amplificar una secuencia de ARN se debe
utilizar primeramente una transcriptasa
Deben tenerse reversa.
en cuenta los posibles
contaminantes presentes en el ADN molde, que
pudieran disminuir la eficiencia de reaccin:
Urea
SDS
Acetato de sodio
Agarosa
Fenol

La cantidad de ADN molde a utilizar depende de la

muestra de partida. Demasiada cantidad de ADN
puede inhibir la reaccin de PCR.
Componentes del sistema de PCR:
ADN molde
 Componentes del sistema de PCR:
cebadores
Longitud de la regin complementaria al
ADN molde de entre 18-25pb.
Deben ser especficos.
No deben presentar auto-
complementariedad.
No deben ser complementarios entre
ellos.
El contenido de G+C debe estar entre el
40-60%.
El Tm de los oligos no debe diferir en ms
de 5C.
La diferencia entre el Tm de los oligos y
del amplicn no debe superar los 10C.
Su concentracin debe ser de entre 0.1-
 Componentes del sistema de PCR:
polimerasa termoestable

Las ADN polimerasas termoestables presentan

las siguientes caractersticas:
Polimerizan en direccin 5 3.
Necesitan de un extremo 3-OH libre para
comenzar la polimerizacin.
Incorporan dNTPs por complementariedad en
una cadena que sirve de molde.
Necesitan la presencia de Mg para funcionar.
Son capaces de resistir altas temperaturas
por perodos considerables.
 Componentes del sistema de PCR:
polimerasa termoestable
Existe una variedad de enzimas con
caractersticas diferentes, segn la finalidad de la
PCR a realizar.
ADN polimerasa Vida A) B) C)
media
(95C)
Taq (Thermus aquaticus) 40 + - -
Vent (Thermococcus 400 - + -
litoralis)
Pfu (Pyrococcus furiosus) 120 - + -
Tth (Thermus thermophilus) 20 + - +
A)Actividad exonucleasa 5
3.
B)Actividad exonucleasa 3
 Componentes del sistema de PCR:
solucin buffer y MgCl

Se utiliza un buffer Tris-HCl, de pH

8,4 (t amb).
La concentracin de MgCl influye
directamente en la actividad de la
polimerasa, y es uno de los parmetros a
ajustar:
Si la concentracin de Mg2+ es deficiente, la
eficiencia de la enzima.
Si la concentracin de Mg Conces
2+
deexcesiva,
ADN moldede
la
La polimerizacin inespecfica.
concentracin ideal de partida.
Conc. y longitud de
MgCl vara entre 0,5-5mM, cebadores.
dependiendo de: Long. del
amplicn.
Conc. de
dNTPs.
 Componentes del sistema de PCR:
dNTPs

Generalmente se utilizan concentraciones

equimolares de los 4 dNTPs (dATP, dCTP,
dGTP, dTTP) en concentraciones que varan
entre 200 250 M de c/u.
Concentraciones mayores a 4mM inhiben la
PCR por quelacin de Mg2+.
 Protocolo tpico de una reaccin
de PCR.

1) Desnaturalizacin (94 95C; 5

min)
2) Desnaturalizacin (94 95C; Los pasos 2,
3y4
30 seg 1 min)
constituyen
3) Hibridacin (t especfica para
un ciclo de
c/par de cebadores; 30 seg) PCR y se
4) Elongacin (72C; 30 seg 3 repiten
min, dependiendo del tamao del entre 25-35
amplicn) veces.
5) Elongacin (72C, 5 min)
 Etapas de un ciclo de PCR.

94
C 72
C

Tm
Prime
rs

(min
)
Etapas de una PCR: Mezcla inicial
Etapas de un ciclo de PCR:
Desnaturalizacin
Etapas de un ciclo de PCR:
Hibridacin
Etapas de un ciclo de PCR:
Elongacin
Reaccin de PCR: esquema de
amplificacin exponencial
 Prdida de eficiencia de PCR
Fase
Fase de Factores que llevan a
lag meset la prdida de
a eficiencia de PCR
[ADN

luego de varios
]

ciclos:

Disminucin de
actividad de la
polimerasa.
Disminucin de la
N de disponibilidad de
ciclo dNTPs y cebadores.
Fase Disminucin de la
exponenci disponibilidad de
al 2+
 Tipos de PCR.

PCR-semicuantitativa
PCR-cuantitativa (PCR-en
tiempo real)
RT-PCR
PCR-multiplex.
PCR-anidada.
PCR-aleloespecfica.
PCR-mutagnesis dirigida.
 PCR cuantitativa: PCR en Tiempo
Real obtenido a partir de
Permite cuantificar el producto
cada muestra mientras se lleva a cabo la
amplificacin.
El equipo se compone de un termociclador y un
lector de fluorescencia, adosados a un equipo de
recoleccin de datos (ordenador).
Para la
cuantificacin se
establece un valor
de corte (valor
umbral) de
fluorescencia
emitida por las
muestras. Una
muestra con mayor
concentracin inicial
 RT-PCR
Se parte de una muestra de ARN.
Se realiza primero una transcripcin reversa,
para obtener DNA copia y luego se realiza la
reaccin de PCR.
 PCR multiplex
Permite amplificar distintos blancos a la vez
en una muestra.
Se utilizan 2, 3 o ms pares de cebadores.
 PCR anidada
Consiste en amplificar un blanco con un par
de cebadores, y en una reaccin posterior
amplificar una fraccin interna del fragmento
previamente amplificado.
Aumenta la especificidad de amplificacin.
 PCR alelo especfica
Se disean cebadores que hibridan
especficamente con el alelo wild type o con el
mutado.
Permite la identificacin de individuos que
presenten dos alelos normales, de portadores
de mutacin, y de individuos con dos alelos
mutados.
Mutagnesis dirigida por PCR

Consiste en introducir una modificacin en la

secuencia del amplicn obtenido mediante el
diseo de un cebador que contenga dicha
mutacin.