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Tecnologia do DNA Recombinante

Isabel Oliveira
As modificaes genticas surgiram
como uma consequncia do cultivo

A representao de
sementes de plantas
boas aumentava
em geraes
subsequentes

Variao
natural entre
a populao
Atualmente

Conhecimentos cientficos, DNA


Ex: teorias de Mendel, Darwin
Modificao de fato nos organismos
Formao de hbridos

DNA recombinante:
Descrito primeiramente em 1972 por Paul Berg
DNA recombinante
DNA Recombinante so molculas de DNA que possuem
fragmentos de DNA derivados de duas ou mais fontes

Tem como base a clonagem molecular.


DNA recombinante
Como obter o DNA
Os passos bsicos envolvidos na extrao do DNA consistem de:
1. Lise celular. O primeiro passo envolve a quebra da clula para
acessar o DNA. Isto pode ser feito utilizando mtodos fsicos ou
qumicos.
2. Remoo de lipdios. Remoo ou separao da membrana lipdica
e restos celulares. Isto normalmente feito utilizando detergentes
como SDS, e por centrifugao.
3. Desproteinao do extrato celular. A desnaturao proteica feita
utilizando proteases como pronases e proteinases K. Aps a
desnaturao, as protenas so separadas do extrato celular.
4. Remoo do RNA. A remoo do RNA feita adicionando uma
RNAse, que rapidamente degrada RNA em subunidades de
ribonucleotdeos. Este passo normalmente opcional na maioria
dos kits.
5. Precipitao/agregao/eluio de DNA

http://www.labome.com.br/method/DNA-Extraction-and-
Purification.html

Atualmente kits comerciais permitem a extrao rpida de DNA de


Vetor

So molculas de DNA capazes de amplificar, em centenas de


cpias, a informao gentica que neles foi inserida. Existem
diferentes tipos de vetores possuindo cada um particularidades.

Todo vetor precisa ter:


Uma origem de replicao
Um marcador selecionvel
Stio de restrio para endonuclease (ao menos
um)
Tipos de vetores:

1) Plasmdeos
2) Fagos
3) Cosmdeos
4) Fagemdeos
5) Cromossomos artificiais
de bactrias
6) Cromossomos artificiais
de leveduras
7) Vrus
Plasmdeo
Pequenas molculas de DNA
dupla fita circulares
Geralmente no codificam
genes fundamentais mas
conferem resistncia a
antibiticos
Presente em bactrias e
algumas leveduras
Aceitam insertos de DNA de
at 5 kb
(principal desvantagem)
No muito eficiente (menos
de 1 em 1000 plasmdeos
so transformados)
Enzima de restrio
Existem 3 tipos
Tipo II a mais importantes
Reconhecem segmentos de 4-8 bp, precisam de
Mg2+ como cofator
Sequncia palindrmicas
Cliva em dois lugares
DNA Recombinante

DNA de interesse(inserto)
Vetor
Enzima de restrio
DNA Ligase
Clula hospedeira
Transformao
Insero do plasmdeo na bactria (ou seja, inserir o
vetor recombinante dentro do hospedeiro)

Eletroporao Aplicao de corrente eltrica,


formando poros na membrana da bactria.
Plasmdeos pequenos so mais eficientes.
Eletroporador
Transformao
Insero do plasmdeo na bactria.

Choque trmico (transformao com cloreto de clcio)


Os ons atuam neutralizando as cargas negativas da membrana e do
DNA. Aps um choque trmico na temperatura de 37 a 42C, criam-se
poros na membrana e o DNA pode alcanar o interior da clula
Transformao

Outros exemplos:
Biobalstica
Injeta partculas (geralmente metais
pesados) recobertas com preparaes de
DNA (plasmdeos) que contm o gene de
interesse, diretamente no citoplasma das
clulas alvo.

Microinjeo
Seleo de clulas transformadas
Resistncia a antibiticos
Seleo de clulas transformadas
Fluorescncia

Colnias bacterianas com e


Cepas distintas de E.coli, cada
sem o plasmdeo contendo um
cepa expressa uma protena
gene para a protena de
fluorescente de cor diferente
fluorescncia verde.
Aplicaes
Organismos Geneticamente Modificados (OGM)
Bibliotecas genmicas
Estudo da estrutura dos genes
Substncias com aplicao mdica ou farmacutica, como insulina,
hormnio do crescimento e fatores de coagulao sangunea;
Etc.
Resumo

DNA
Recombinante

Transformao:
Eletroporao
Choque trmico
Biobalstica
Microinjeo

Seleo das clulas


transformadas :
Resistncia a
antibiticos
Fluorescncia

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