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Eletroforese em

Anlise de cidos
Nucleicos

Profa. Dra. Rejane da Silva Sena Barcelos.


Eletroforese em Anlise de cidos
Nucleicos
Eletroforese em gel
Tcnica de separao de molculas que envolve a
migrao de partculas em um determinado gel
durante a aplicao de uma diferena de potencial.

As molculas so separadas de acordo com o seu tamanho,


pois as de menor massa iro migrar mais
rapidamente.

Em alguns casos, o formato da molculas tambm influi, pois


algumas tero maior facilidade para migrar pelo gel.

A eletroforese normalmente utilizada para separar


protenas e molculas de DNA e RNA.
Eletroforese em Anlise de cidos
Nucleicos
A anlise de DNA por eletroforese uma das tcnicas
fundamentais nos laboratrios de pesquisa e de
diagnstico.

O princpio baseado no fato da molcula de DNA possuir


carga negativa em valores de pH neutro ou alcalino e
quando aplicado ou imerso em uma matriz de gel
submetida a um campo eltrico, migra em direo ao plo
positivo (ando).

A velocidade da migrao depende do tamanho da molcula.


Por isso em um dado momento da eletroforese
molculas de tamanhos distintos se encontram em
diferentes pontos da matriz.
Eletroforese em Anlise de cidos
Nucleicos
Matriz - agarose ou poliacrilamida

Depende do tamanho dos fragmentos de DNA que se


pretende separar e visualizar.

Devido diferena no tamanho dos poros dessas matrizes:

Gel de agarose para a separao de fragmentos que


variam de 0,2 kb a 50 kb (1 kb = 1000 pares de bases)

Gel de poliacrilamida para separao de fragmentos


pequenos, de at 1kb.
Eletroforese em Anlise de cidos
Nucleicos
CUIDADOS:

Poliacrilamida em soluo - neurotxica.

A preparao do gel exige certa cautela.

mais laboriosa, requerendo a mistura de

componentes adicionais poliacrilamida para ajudar

na polimerizao e mais tempo para que a polimerizao

ocorra.
Eletroforese em Anlise de cidos
CUIDADOS: Nucleicos

Agarose - mistura de um tampo e agarose, no txica.

Polimerizao mais rpida e o gel pode ser reciclado aps o


uso, isto , pode ser reutilizado na elaborao de
outros gis.

Usado como mtodo analtico ou preparativo, isto , quando o


fragmento de DNA recuperado e purificado a partir do
gel.
Eletroforese em Anlise de cidos
CUIDADOS: Nucleicos
Agarose -

Desvantagem: Colorao com brometo de etdio (EtBr) -


substncia mutagnica.
necessria a utilizao de transiluminador de luz ultravioleta.
Gel de Agarose
Soluo Tampo
Pente
Poo
Gel agarose
Gel de Agarose
Gel de Agarose
Agarose

um polissacardeo extrado de algas marinhas, formado por


resduos de D e L galactose unidos por ligaes glicosdicas
(1-3) e (1-4), um material gelatinoso e semelhante a
gelatina incolor.
Forma uma rede que segura as molculas durante a migrao.
Separa molculas com dimetro igual ou superior a 10 nm.
Gel de Agarose
Rede formada pela solidificao de um polmero
linear com filamentos finos entrelaados
Agarose: Colide natural
Gel de Agarose

A agarose dissolvida em gua fervendo e forma um


gel quando esfria.
Formao de duplas hlices que se juntam
lateralmente.
Gel de Agarose
Gel de Agarose
Um fragmento de DNA possui uma mobilidade eletrofortica que decresce
em proporo ao logaritmo do seu tamanho em pares de bases.
Fragmentos maiores movem-se mais lentamente.
Essa proporcionalidade depende:

- concentrao do gel de agarose

- composio do tampo de corrida

- condies eletroforticas
Diferentes concentraes de agarose permitem uma separao eficiente de
diferentes tamanhos de DNA.
Gel de Agarose
Tamanho dos poros do gel de agarose:
diretamente proporcional ao tamanho do fragmento que
se deseja separar.

O tamanho do poro, ou a porosidade do gel definido pela


concentrao do gel.

Quanto menor for a concentrao do gel maior ser a


porosidade e, portanto, maior o fragmento de DNA que poder ser
separado
Quanto menor a concentrao do gel, mais frgil ele se torna.
Geralmente se trabalha com gis de agarose de 1 a 1,5%,
dependendo do fragmento de DNA esperado.
Gel de Agarose
Concentrao: dada como peso de agarose
por volume de gua.

Gis a 1%:
poros em torno de 150 nm

Gis a 0,16%:
poros em torno de 500 nm
Fatores que afetam a
migrao
Tamanho da molcula
Concentrao do gel
Define o tamanho dos poros
Conformao do DNA

Fora eltrica aplicada


Voltagem (Volts)
Corrente (Ampres)
Fora (Watts)

Presena de corantes intercalantes


Composio do tampo
Gel de Agarose

SOLUES E REAGENTES

Tipos de tampes:
a) TAE (Tris-acetate-EDTA electrophoresis buffer Tampo
de eletroforese-Tris-acetato-EDTA)

b) TPE (Tris-phosphate-EDTA electrophoresis buffer


Tampo de eletroforese-Tris-fosfato-EDTA)

c) TBE (Tris-borate-EDTA electrophoresis buffer Tampo


de eletroforese-Tris-borato-EDTA)
Gel de Agarose
Tampo de carregamento (loading buffer):
Misturado s amostras antes de aplicar no gel.

Finalidades:
1) Aumentar a densidade da amostra

2) Adicionar cor s amostras

Colorao do gel:
Brometo de etdeo (agarose e poliacrilamida)
Aplicao das amostras:
Antes da aplicao, as amostras de DNA devero ser
misturadas a um tampo de amostra.
Contm corantes e reagentes de alta densidade
(sacarose, glicerol ou ficol).
Asseguram que a amostra de DNA entre no poo pela fora
da gravidade.
Corantes azul de bromofenol e o xileno cianol, facilitam a
aplicao da amostra no gel (acrescentam cor na
amostra) e auxiliam no monitoramento da corrida, j que
apresentam velocidade conhecida durante a migrao na
matriz em direo ao plo positivo.
Tamanho dos fragmentos
Estimativa visual do tamanho dos fragmentos de DNA
necessrio aplicar em um dos poos o marcador de
massa molecular (ladder).

Ladder uma mistura de diversos fragmentos


de DNA de tamanhos e concentraes
conhecidos, gerados a partir da digesto de
plasmdeos (DNA circular - bactrias) com
enzimas de restrio.

Permite inferir, por comparao, o tamanho dos


fragmentos presentes na amostra analisada.

Ladder 1kb -13 fragmentos (0,3 a 10 kb)

Ladder 100bp -14 fragmentos (0,1 a 5 kb)


Gel de Agarose
Corantes:

EtBr - brometo de etdeo


Intercala-se com a molcula de DNA a cada 2,5 bp do
fragmento. Aps sua insero esse exerce uma ligao do
tipo van der Waals.
Radiao UV - capaz de estimular essa ligao entre o
DNA e o corante tornando a banda visvel no gel atravs de
um dispositivo de transiluminao.

Brometo de etdeo mutagnico!!!


Gel de Agarose
A intensidade de fluorescncia emitida proporcional
concentrao de DNA presente na amostra.

Pode ser utilizado de 3 diferentes formas:

- aplicado diretamente no gel

- no tampo da amostra

- aps a corrida quando o gel


submergido em soluo de EtBr.

EtBr - brometo de etdeo


Transiluminador

VDS
Gel de Agarose
Gel de Agarose
Corantes:

SYBR Green I
Corante intercalante que pode detectar at 20pg
de DNA-dupla fita
Brometo: 1 a 10 ng de DNA, no mnimo, para dar sinal
fluorescente
Sensibilidade 50 a 100 vezes maior
que o brometo
Menos mutagnico
Gel de Agarose

SYBR Green I
Gel de Poliacrilamida
Separao de molculas e DNA.

Forma uma malha com poros que permite a passagem das


molculas e sua separao de acordo com suas
caractersticas.

A poliacrilamida uma mistura de polmeros, acrilamida e


bisacrilamida.

A acrilamida uma molcula linear, enquanto a bisacrilamida


tem forma de "T". Misturando essas duas molculas,
temos a formao de uma "rede".

Diferentes concentraes dessa molculas permitem a


criao de diferentes gradientes de separao.
Gel de Poliacrilamida
Preparo gel de poliacrilamida: misturar as duas substncias
formadoras nas concentraes desejadas, coloc-las em
um suporte de vidro, e adicionar Temed e S208, que
atuam como catalizadores da polimerizao.