Validación de Metodos - Coppari

VALIDACIN DE MTODOS
Definiciones y Conceptos
QA UB- Mayo 2008

Lic. M.A.Coppari
Objetivo global
Revisar los conceptos de validacin,
prevalidacin, verificacin de mtodos
Unificar definiciones de los parmetros a validar,
aproximaciones experimentales y documentacin
a archivar
Introducir los conceptos de revalidacin y
modificacin de mtodos vs ajustes.
Qu validar en funcin de la aplicacin del
mtodo
QA UB 2008- Lic. M.A.Coppari 2

Procedimiento Analtico
Describe los pasos que se siguen para
realizar el anlisis. Puede incluir (sin
limitarse a) los siguientes tems :
Preparacin de muestras, estndares de
referencia y reactivos
Instrucciones para el uso del equipamiento
Clculos

Cmo validar mtodos
Definir el objetivo del procedimiento
analtico.
Encuadrarlo en las siguientes categoras:
Valoracin / Uniformidad de contenido/Potencia de
Macrocomponente o un conservante
Determinacin de Impurezas
Disolucin (medicin)
Mtodo de Identificacin

Cmo validar mtodos
En el caso de determinar impurezas (y/o
productos de degradacin) definir si se
realizar:
Cuantificacin (ej.: 1 - 10 ppm)
Ensayo lmite (ej.: No ms de 10 ppm)
Definir las caractersticas de validacin a
ser evaluadas en base a la siguiente tabla:

Cmo validar mtodos
USP <1225> General Information. Validation of Compendial Methods
Categora I Categora II Categora III Categora IV

Caracterstica de performance [1] Cuantitativos Ensayos lmites [2] (Identificacin)
Exactitud Si Si * * No
Precisin Si Si No Si No
Especificidad Si Si Si * Si
Lmite de deteccin No No Si * No
Lmite de cuantificacin No Si No * No
Linealidad Si Si No * No
Rango Si Si * * No
[1] Activos, incluyendo conservantes

[2] Determinacin de caractersticas de performance del producto
* Puede ser requerido, dependiendo de la naturaleza especfica del ensayo.

Cmo validar mtodos
NOTAS sobre la tabla:
(1) La falta de especificidad de un mtodo
analtico podra ser soportada con otro
procedimiento analtico que lo soporte.
(2) Podra ser necesario determinar el Lmite de
Deteccin en ensayos de Cuantificacin de
impurezas

Documentacin previa
Procedimiento operativo o plan maestro de validacin
incluyendo criterios de revalidacin (general).
Metodologa o procedimiento analtico claramente definido

(especfico).
Protocolo de validacin (especfico)

Propsito y alcance del mtodo.
Parmetros a evaluar
Criterios de aceptacin

Etapa de planificacin
Verificar el funcionamiento de las caractersticas relevantes
del equipo.
Calificar los materiales, ej., estndares y reactivos para

pureza, cantidades exactas y estabilidad suficiente.
Realizar experimentos pre-validacin.
Ajustar los parmetros del mtodo y/o criterios de

aceptacin si es necesario.

Pre-validacin
Puede cumplirse el LC
Es suficientemente selectivo?
Placebo/placebo degradado
Muestras degradadas
Impurezas conocidas y productos de degradacin
(pureza de pico)
Linealidad del activo

Linealidad de impurezas

Etapa experimental, evaluacin y reporte
Realizar experimentos completos.
Evaluacin de resultados
Necesidad de mayor trabajo experimental
Evaluacin estadstica de los datos
Documentar los experimentos de validacin (datos

crudos).
Reporte de validacin
Una copia del procedimiento analtico o al menos la referencia al
mismo deben ser parte del reporte
Validation and Qualification in Analytical Laboratories
Ludwing Huber. InterPharm Press, In (1998)

Especificidad - definiciones
Es la capacidad para determinar
inequvocamente el analito en presencia de
componentes que pueden estar presentes.
Generalmente estos pueden incluir:
Impurezas
Productos de degradacin
Matriz
Otros
Especificidad - definiciones
Se aplica a:
Identificacin
Test de impurezas (lmites o cuantitativos)
Ensayos de valoracin o potencia
Pregunta: para todos los mtodos debe demostrarse la

especificidad?

Especificidad
Demostrar la separacin entre el componente a

valorar y los dos componentes que eluyan con
separacin ms crtica.
En ensayos de impurezas comparar perfiles de

impurezas entre dos mtodos.

Si se dispone de impurezas, productos de
degradacin y/o excipientes:
Demostrar que la presencia de estas sustancias no
afectan el resultado de la valoracin.
Si NO se dispone de impurezas y/o

productos de degradacin:
Comparar los resultados de la valoracin contra los
obtenidos con un mtodo validado.
Degradaciones forzadas con o sin excipientes?

Demostrar la homogeneidad o pureza del pico de
inters

Demostrar la homogeneidad o pureza del pico de
inters

Efecto de envejecimiento de
excipientes
A: HPLC de un extracto de placebo
degradado que muestra la aparicin
de un pico extra debido a la
degradacin de un excipiente.
B: Extracto de la formulacin que
muestra la falta de Especificidad
para resolver los componentes
durante una estabilidad.
C: Cromatograma de la mezcla en una
columna diferente que muestra la
resolucin entre ambos picos.
Kirschbaum, J.J.Journal of Pharm & Biomed Analysis, 7 (7), 813-833, 1989.

Especificidad - Documentacin
o Cromatogramas
o Factores de capacidad (k) o tiempos de retencin
relativos (trr)
o Resolucin (R)
o Eficiencia (N)
o Factor de asimetra (T)
o Resultados de muestras enriquecidas o marcadas
o Reportes de DAD y/o MS
o ANOVA o Test F (comparacin de precisin)
o Test t (comparacin de medias)

Exactitud - definiciones
Expresa la concordancia entre el valor
aceptado como verdadero (ya sea de
referencia o convencional) y el valor
encontrado)
Generalmente se habla de recuperacin del

analito.

Exactitud
Establecer la exactitud para el rango
especificado del procedimiento analtico.
Puede determinarse concurrentemente
cuando se determinan la precisin,
linealidad y especificidad.

Exactitud - Producto Terminado
Aplicacin del procedimiento analtico
sobre una mezcla sinttica de los
componentes del producto terminado con
analito en concentracin conocida.
Utilizar un mtodo de estndar agregado.
Comparacin de los resultados con los
obtenidos por otro mtodo validado.

Exactitud - Cuantificacin de Impurezas
Aplicacin del procedimiento analtico sobre
una muestra (materia prima o producto
terminado) enriquecida con cantidades
conocidas de impurezas.
Utilizar un mtodo de estndar agregado.
Comparacin de los resultados con los
obtenidos por otro mtodo validado.
Puede utilizarse el factor de respuesta de la
impureza respecto al activo.
Exactitud - Documentacin
Informar como % de Recuperacin o diferencia
entre valor hallado y valor verdadero.
o Considerar la posible presencia del analito en la matriz
cmo puede resolverse?
9 determinaciones (como mnimo) utilizando 3
concentraciones diferentes (como mnimo) para
cubrir el rango especificado.
Calculo del intervalo de confianza.
Representacin grfica (opcional).
Aplicacin de ensayos de comparacin estadstica
de series (test F, test t).
Precisin
Expresa la concordancia (o dispersin) entre una serie
de medidas obtenidas del anlisis mltiple de una misma
muestra homognea de acuerdo a las condiciones
descriptas en el procedimiento analtico.
Puede ser considerada en tres niveles:

Repetibilidad
Precisin Intermedia
Reproducibilidad
y se expresa como la desviacin standard o el coeficiente

de variacin de la serie de mediciones.
Repetibilidad
Expresa la precisin de acuerdo a las
mismas condiciones de operacin durante
un corto perodo de tiempo
Tambin puede denominarse Precisin

Intra-ensayo.
No confundir con precisin del sistema

Precisin Intermedia
Expresa las variaciones dentro de un mismo
laboratorio: diferentes das, diferentes analistas,
equipos diferentes, etc.
Reproducibilidad
Expresa la precisin entre laboratorios
Estudios colaborativos, utilizados para la
estandarizacin de la metodologa. Excede la
validacin analtica intralaboratorio.
Repetibilidad
9 determinaciones (como mnimo), con 3
concentraciones dentro del rango especificado.
6 determinaciones (como mnimo) a 100% de la

concentracin terica del analito.
Replicados genuinos, aplicando el mtodo completo

Precisin intermedia
Depende de las circunstancias bajo las cuales se
utilizar el procedimiento.
Incluir diferentes das, analistas, equipos, etc.
Utilizar un diseo matricial.

Precisin - Documentacin
Informar resultados en forma tabular

Valor promedio
Desviacin estndar (s)
Informar Desviacin Estndar Relativa
(CV%)
Informar Intervalo de confianza.

Linealidad
Es la capacidad de obtener resultados de
prueba (dentro de un determinado rango)
que son directamente proporcionales a la
concentracin (cantidad) de analito en la
muestra.

Linealidad
Establecer la linealidad para el rango especificado, de
acuerdo con la aplicacin del mtodo y las
especificaciones fijadas para el analito de inters.
Demostrar la linealidad entre la concentracin del analito y
la respuesta del detector utilizando diferentes pesadas o
diluciones del estndar de referencia. No menos de 5
concentraciones. Emplear grficos y clculos estadsticos.
Es recomendable repetir el ensayo de linealidad en 3 (tres)
das diferentes.

Rango lineal, relacin con LD y LC

Linealidad - Documentacin
Grfico de Respuesta vs. Concentracin.
Regresin lineal por Cuadrados Mnimos.
Ecuacin de la recta ( pendiente e intercepto en
y)
Coeficiente de correlacin.
Suma de cuadrados residual (Sy/x).
Anlisis de la desviacin de la informacin real
desde la lnea de regresin. (Ej.: lmites de
confianza de la regresin)

Rango
Es el intervalo entre la concentracin
(cantidad) ms alta y ms baja de analito en
una muestra (incluyendo estas
concentraciones), para el cual se ha
demostrado que el procedimiento analtico
posee un nivel adecuado de precisin,
exactitud y linealidad.

Rango
Elrango especificado deriva de los estudios
de linealidad y depende de la aplicacin
pretendida del procedimiento.
Elprocedimiento analtico debe

proporcionar un grado aceptable de
linealidad, exactitud y precisin dentro del
rango especificado.

Rango - Documentacin
Considerar los siguientes rangos mnimos:
Valoracin: 80 -120 % del terico.

Cuantificacin de impurezas: LC 50% de la especificacin
(el que fuere mayor) al 120% de especificado.
Impurezas txicas potentes: Ajustar en cada caso de
acuerdo a toxicidad o efectos farmacolgicos, considerando
el LD o LC. Uniformidad de contenido: mnimo 70-130% del
terico.
Disolucin: 20 % del rango especificado (o LC al +120%
para productos de liberacin prolongada).

Lmite de Deteccin
Es la cantidad ms baja de analito en una
muestra que puede ser detectado, pero no
necesariamente cuantificado como un valor
exacto.

Lmite de Deteccin
1,5
-0,5 0 50 100 150 200

T i e m p o ( se g )
Seal analtica
Analito no Analito
detectado detectado
0 LD
1,5
-0,5 0 50 100 150 200


Lmite de Deteccin
Para procedimientos instrumentales:
Relacin Seal/Ruido:
Determinar relacin seal / ruido con concentraciones
bajas de analito vs. blanco
Considerar S/R=3/1 o 2/1 como aceptable.

Lmite de Deteccin
Basados en la desviacin estndar:
LD = 3.3 s / b
Donde:
s = Desviacin estndar de la respuesta (ej. blanco, desviacin estndar
residual o del intercepto).
b = Pendiente de curva de calibracin

Valores de desviacin estndar a partir de
la recta de regresin

Lmite de Deteccin - Documentacin
Informar Lmite de Deteccin.
Informar mtodo utilizado para determinarlo.
Si se obtiene por clculo o extrapolacin debe ser

subsecuentemente validado por el anlisis independiente
de una cantidad adecuada de muestras preparadas cerca o
en el lmite de deteccin.
Dependiendo de la importancia del valor, debe ser

efectuado en ms de un da (ej. equipos, edad de las
columnas, etc).

Lmite de Cuantificacin
Es la cantidad ms baja de analito en una
muestra que puede ser determinada
cuantitativamente con adecuada precisin y
exactitud.
Se emplea como un parmetro para

cuantificar niveles bajos de impurezas y/o
productos de degradacin.

1,5
-0,5 0 50 100 150 200

Seal analtica
Analito no Regin de Regin de
detectado deteccin Cuantificacin
0 LD LC
1,5 1,5
-0,5 0 50 100 150 200

T i e m p o ( se g ) -0,5 0 50 100 150 200
Tiem po (seg)

Relacin Seal/Ruido:
Determinar relacin seal / ruido con concentraciones
bajas de analito vs. blanco
Considerar S/R=10/1 como aceptable.

Basados en la desviacin estndar:
LD = 10 s / b
Donde:
s = Desviacin estndar de la respuesta (ej. blanco, desviacin
estndar residual o del intercepto).
b = Pendiente de curva de calibracin

determinacin segn Eurachem

Lmite de Cuantificacin - Documentacin
Informar Lmite de Cuantificacin
Informar mtodo utilizado para determinarlo.
Debe ser subsecuentemente validado por el anlisis de una

cantidad adecuada de muestras preparadas cerca o en el
lmite de cuantificacin.
Dependiendo de la importancia del valor, debe ser efectuado

en ms de un da (ej. equipos, edad de las columnas, etc).

Robustez
Es una medida de la capacidad del procedimiento
analtico para no ser afectado por pequeas (pero
deliberadas) variaciones en sus parmetros
operativos, y proporciona una indicacin de su
confiabilidad durante su uso normal
Actualmente se la considera parte del desarrollo del mtodo y
se la excluye de la validacin)
Provee una idea de la confiabilidad durante su uso normal
(entre das y quizs entre diferentes laboratorios).
Permiten indicar los ajustes a realizar cuando no se cumplen
los criterios establecidos para el test de adecuacin del
sistema.
Estabilidad de las Soluciones de
Medida
Las condiciones en que va a estudiarse este parmetro, van a
depender del tipo de trabajo
Otras condiciones a tener en cuenta son:

Condiciones ambientales hasta el momento del anlisis.
En inyectores automticos, tiempo de espera para ser analizada
Para muestras biolgicas:
Estabilidad al congelado/descongelado.
Nmero de ciclos de congelacin/descongelacin que soportan las
muestras, estabilidad a corto y largo plazo, etc.
Temperatura del ensayo y tiempo de preparacin de muestra.

Robustez
Algunos factores que influencian la robustez del mtodo HPLC
Sistema HPLC Tiempos de formacin de gradiente, volumen muerto
Estabilidad del detector y repetibilidad de la longitud de
onda
Columna: Estabilidad de la fase estacionaria, edad de la columna
Temperatura
Reproducibilidad entre lotes
Uso de pre y guardacolumnas
Fase mvil Solventes, mezclado manual vs mezclado en bomba, pH,
flujo
Reproducibilidad de la composicin de la fase mvil
Manejo de Algoritmo de integracin
datos

Robustez
En HPLC se pueden examinar los siguientes parmetros
operativos:
Diferentes columnas (igual o distinto proveedor).

Variacin del pH del buffer en 0,5 unidades.
Variacin del contenido de modificador orgnico en 5%.
Variacin del flujo en 0,2mL/min.
Variacin de la temperatura en 2C.
Variacin de la longitud de onda en 5nm.
Distintos equipos
Edad de la columna cromatogrfica.
Adems pueden evaluarse cambios en la preparacin de

la muestra (ej. tiempo de agitacin para extraer el
compuesto de inters, etc).
Robustez
Variabilidad inter-columnas
El objetivo de este ensayo es
comprobar la constancia en el
perfil cromatogrfico, cuando
se utilizan columnas de
diferentes lotes, del mismo
fabricante (por lo menos 2).

Otros conceptos
Verificacinde mtodos compendiales
Ajustes de mtodos versus modificaciones
Revalidacin
Transferencia

Verificacin de mtodos
compendiales
No se requiere validacin para los mtodos
analticos compendiales.
Segn 21 CFR 211.194(a)(2) the
suitability of all testing methods used shall
be verified under actual conditions of use

compendiales: los 6 elementos
El proceso de verificacin est compuesto por 6
elementos:
Personal calificado
Procedimiento escrito y protocolo del estudio (ej.
nmero de lotes a ensayar, ID).
Criterios de aceptacin de resultados
Resultados
Reporte (incluyendo desviaciones)
Acciones correctivas si son necesarias (ej. contactar
USP).
Y si no puede verificarse adecuadamente el mtodo?
compendiales
No se requiere verificacin para ensayos de tipo
general como residuo de ignicin.
Bsicamente se requieren para:
Valoracin de un activo o conservador
Pureza cromatogrfica
Ciertas impurezas particulares (ej. Solventes residuales)
Determinaciones especficas crticas para el producto
(ej. Viscosidad).
Puede ser necesario estudiar la sensibilidad del
procedimiento a cambios no planificados o ajustes
(robustez).
Ajustes vs. Modificaciones
Pharm Tech, June 1998, 58-64

(http://www.layloff.net/fda/1998system.PDF)
USP <621> Chromatography, USP 30
Los ajustes son aceptables solamente cuando se

cuenta con todas las sustancias de referencia.
No deben efectuarse para compensar o evitar la
prdida de eficiencia del sistema.
Deben evitarse mltiples ajustes.

Algunos ejemplos:
HPLC
pH de la fase mvil: 0.2 unidades del valor o rango
especificado.
Fuerza inica: 10% del valor indicado en la monografa.
Relacin de componentes de la fase mvil (sobre el
minoritario): 30% relativo pero no puede superar el 10%
absoluto.
o Binarias
o Ternarias
Tamao de partcula: -50%
Temperatura de columna: 10C
Otros: volumen de inyeccin, flujo, longitud de onda, etc.

Algunos ejemplos:
GC
Temperatura de la columna: 10%
Flujo: 50%
Longitud de columna: 70%
Espesor de film: 50% to 100%
Programa de temperaturas: se permiten ajustes en los tiempos
o en las temperaturas 20%
Otros: tamao de partcula, volumen de inyeccin, etc.

Revalidacin de Mtodos
Muestra homognea
Mtodo confiable
Parmetros instrumentales
Pesada de muestra
Preparacin de la muestra
Adecuacin del sistema
Patrones de referencia
Diluciones
Anlisis de
muestra
Qu es asignable al
instrumento, qu al Manejo de datos Pharm Tech, October 1994, 92-100.
analista y qu a ambos? & Reporte
Transferencia de mtodos
Idealmente en 2 lotes, con 3 anlisis en cada uno.
Test de adecuacin del sistema
Promedios de valoracin entre laboratorios: 2%
(activos) o 3% (productos elaborados)
Impurezas conocidas la diferencia absoluta < 0.2%
Impurezas desconocidas: comparacin

Transferencia de mtodos
Promedio de disolucin 6%
Promedio de UC 5%
Linealidad no es un requisito a verificar en la
transferencia
LD y LC deben verificarse
Para mtodos de farmacopea el laboratorio debe
verificar que no hay sustancias interferentes
Analytical Chemistry in a GMP Environment. Edited by J.M.Miller and J.B

Crowther, 2000 Hohn Wiley & Sons, Inc.

Nota adicionales: criterios
mnimos a incluir en otras
metodologas
Mtodos espectroscpicos: deben incluir como mnimo
especificidad (demostrando no interferencia del placebo),
linealidad, repetibilidad, precisin intermedia y robustez.
Rotacin ptica: especificidad y precisin intermedia.
Tamao de partcula: robustez y precisin intermedia
Disolucin: deben validarse el procedimiento de disolucin y

el mtodo de anlisis
Guidance for Industry: Analytical Procedures and Methods Validation

Chemistry, Manufacturing, and Controls Documentation , Aug. 2000

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Categora I Categora II Categora III Categora IV

[1] Activos, incluyendo conservantes

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Metodologa o procedimiento analtico claramente definido

Protocolo de validacin (especfico)

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Calificar los materiales, ej., estndares y reactivos para

Realizar experimentos pre-validacin.

Ajustar los parmetros del mtodo y/o criterios de

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Linealidad del activo

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Documentar los experimentos de validacin (datos

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Pregunta: para todos los mtodos debe demostrarse la

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Demostrar la separacin entre el componente a

En ensayos de impurezas comparar perfiles de

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Si NO se dispone de impurezas y/o

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Kirschbaum, J.J.Journal of Pharm & Biomed Analysis, 7 (7), 813-833, 1989.

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Generalmente se habla de recuperacin del

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Puede ser considerada en tres niveles:

y se expresa como la desviacin standard o el coeficiente

Tambin puede denominarse Precisin

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6 determinaciones (como mnimo) a 100% de la

Replicados genuinos, aplicando el mtodo completo

QA UB 2008- Lic. M.A.Coppari 31

Incluir diferentes das, analistas, equipos, etc.

Utilizar un diseo matricial.

QA UB 2008- Lic. M.A.Coppari 32

Informar resultados en forma tabular

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Elprocedimiento analtico debe

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Valoracin: 80 -120 % del terico.

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-0,5 0 50 100 150 200

-0,5 0 50 100 150 200

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Basados en la desviacin estndar: