2.

ESTRUCTURA Y PROPIEDADES DE
PROTENAS.

http://www.expasy.ch/tools/

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qf 332
 El genoma haploide de un humano
contiene 20,000-25,000 genes que
codifican a protenas.

Transportadores
Enzimas
Receptores
Estructurales
Hormonas
Almacenamiento
Movimiento
 Estructura cuaternaria
Protenas que estn
formadas por una o
ms cadenas
polipeptdicas,
subunidades o
monmeros.
Muchas veces slo
presentan su
actividad cuando
forman el agregado
 Estructura terciaria

Arreglo espacial en el que

las cadenas se pliegan
para dar una forma
compacta (por ejemplo
globular o cilndrica).
El empacamiento espacial
se encuentra determinado
por una combinacin de
estructura: -hlices, -
plegadas y desordenadas
Estructura secundaria

Las protenas adoptan una

conformacin en el espacio
debido a:
1) las interacciones de las
cadenas laterales de sus
residuos de aminocidos y
2) el solvente en el que se
encuentren, dando una
estructura de mxima
estabilidad.
 Estructura primaria

La secuencia lineal de los aminocidos en una protena.

Estructura que identifica a una protena y que le determina sus
caractersticas qumicas y biolgicas.
Las propiedades fisicoqumicas intrnsecas como plegamiento o
conformacin estn sealadas en su estructura primaria
 Unidad estructural de las
protenas: Los aminocidos

1. Alifticos (5): Ala, Val, Leu, Ile, Gly.

2. Hidroxlicos (2): Ser y Thr.
3. cidos o dicarboxlicos y sus amidas (4): Asp, Asn, Glu y Gln.
4. Bsicos (3): Lys, Arg e His.
5. Cclicos (4): Phe, Tyr, Trp y Pro.
6. Contienen sulfuros (2): Met y Cys.
 2. Purificacin de la enzima lactato
deshidrogenasa de msculo esqueltico
de bovino.

PARTE I. EXTRACCIN Y PRECIPITACIN

POR SALADO.
 Para qu purificar una protena?

Fitasa
Lipasa
Hexosa oxidasa
Vacuna Hepatitis B
Insulina
Suero fetal bovino
Gelatina
Colorante de carne
Protena liofilizada Protenas recombinantes
varias

Caracterizacin de la actividad biolgica de la protena.

Para estudios sobre la estructura-funcin
 Gua bsica para la purificacin de
una protena
A. Definir los objetivos de la purificacin. Grado de pureza, cantidad y nivel de
actividad requeridos.
B. Seleccionar la muestra biolgica de inicio. Depender de la localizacin de la
protena tanto en tejidos como en compartimentos extracelulares o intracelulares.
C. Desarrollar una tcnica de anlisis. Para la determinacin rpida de la pureza,
actividad o contenido total de protena. Un mtodo frecuentemente utilizado para
evaluar la pureza es la separacin de la protena mediante electroforesis.
D. Minimizar la manipulacin de la muestra. Evitar los procedimientos largos, ya
que se corre el riesgo de perder la actividad de la protena o reducir el rendimiento.
E. Remover al inicio del proceso los posibles contaminantes. Como por ejemplo
las proteasas.
F. Reducir el uso de aditivos. El uso de muchos y diversos aditivos como sales y
amortiguadores en cada paso, puede llevar a la prdida de la actividad de la
enzima y aumentar los costos de la purificacin. Seleccionar y usar slo lo
necesario.
G. Usar una tcnica diferente en cada paso. Para ello tomar en cuenta las
caractersticas propias de la protena como tamao, carga, hidrofobicidad y
especificidad por ligandos.
H. Minimizar el nmero de pasos. En cada paso se pierde protena
 Fases para la purificacin de
una protena
Fase I. El objetivo inicial es la obtencin del homogeneizado o
extracto crudo y su clarificacin o concentracin.

Fase II. El objetivo principal es remover una cantidad importante

de contaminantes que pueden ser protenas, cidos nucleicos,
toxinas y virus. Uno de los mtodos ms utilizados para eliminar
protenas contaminantes es el de la precipitacin.

Fase III. El objetivo es obtener una protena pura o con mnimas

trazas de contaminantes. Para alcanzar el objetivo se utilizan
uno o la combinacin de varios mtodos cromatogrficos, como
la cromatografa de exclusin molecular, intercambio inico,
interaccin hidrofbica y de afinidad.
 SELECCIN DE LA FUENTE DE
LA PROTENA.
La eleccin de la procedencia de la protena
debe basarse en criterios tales como:

a) la facilidad de obtener cantidades suficientes

del tejido del que se asla la protena,
b) la cantidad de la protena de inters en el
tejido y
c) cualquier propiedad peculiar de la protena
escogida, que ayudar en su estabilizacin y
su aislamiento.
 FASE I
Mtodos para la ruptura
mecnica de las clulas
Mtodo Comentarios
Prensa French Volmenes 50 mL
Sonicacin Disponibilidad de
equipo
Homogenizador Disponibilidad de
equipo

Choque osmtico No se necesita

equipo
Ciclos de Para clulas de
congelacin/descong mamferos, no para
elacin bacterias
Detergentes Pueden
desnaturalizar a
protenas sensibles
 Tamao de las protenas, propiedad
utilizada para su separacin.
El tamao de las protenas es medido usualmente en
masa molecular, aunque algunas veces se menciona su
longitud y dimetro (en ).
El peso molecular es la masa de 1 mol de protena,
usualmente se expresa en daltones.
Un daltn es la masa atmica de un protn o neutrn.
La masa se puede determinar con mtodos como: la
electroforesis, la filtracin en gel y la espectrometra de
masas.
Los mtodos de separacin de protenas en los que se
incluyen tanto forma como tamao son: la cromatografa
en filtracin en gel (size exclusin chromatography y la
electroforesis en gel de poliacrilamida.
 FASE I

Centrifugacin
La centrifugacin aprovecha la
propiedades de tamao, forma
y densidad de las protenas
para separarlas de otras
molculas que presentan
caractersticas distintas.
Como resultado, el efecto de la
gravedad para cada protena
es diferente.
En principio, se pueden
separar organelos de una
solucin homognea de
partculas, al exponer a la
muestra a diferente fuerza
gravitatoria.
 FASE I
Diagrama de flujo para la obtencin
de diferentes fracciones subcelulares

Centrifugacin diferencial
 FASE II
Remover contaminantes y/o
concentrar la muestra
Precipitacin:
cambio de pH, incremento en la
temperatura, adicin de solventes,
molculas cargadas, etc.
Pero, el mtodo ms comnmente
empleado es la precipitacin por salado
con (NH4)2SO4.
 FASE II

Solubilidad

Es la cantidad de soluto que puede disolverse en un solvente.

La estructura 3-D de la protena afecta sus propiedades de
solubilidad.
Las protenas citoslicas son abundantes en aminocidos
hidrofilicos en su superficie.
De manera opuesta a las protenas membranales.
Cada protena tiene una solubilidad caracterstica en un
ambiente definido y si se cambian esas condiciones
(amortiguador, tipo de solvente, pH, fuerza inica, temperatura, etc.)
puede causar que las protenas pierdan sus propiedades de
solubilidad y precipiten en solucin.
 FASE II

Salting in y salting out

Salting in. Las protenas globulares aumentan
su solubilidad al incrementar la concentraciones de
iones.
Pero cuando se eleva la concentracin de iones la
protena disminuye su solubilidad y se agrega
(salting out).
 Fase I

Cmo vamos a
purificar a la
lactato
deshidrogenasa
de msculo de
bovino?
 FASE II
Cmo calcular la concentracin de
sulfato de amonio a utilizar?
Formulas o tablas
Y tambin en internet
http://www.proteinchemist.com/cgi-
bin/s2.pl
Conocer:
1. Sulfato de amonio slido
2. Conocer el volumen de la solucin
3. Y la concentracin final de la sal
Eliminar la sal
Una vez que se obtiene el pp de una
mezcla protena hay que eliminar la sal
o medio utilizado para la precipitacin.
La sal puede interferir en los posteriores
pasos de purificacin
La sal puede alterar las propiedades
biolgicas de la protena
 Bajar o eliminar la
concentracin de sal
Dilisis
Utilizar la cromatografa
filtracin en gel, para
perder las molculas de
bajo peso molecular
(Sefadex-G25).
Utilizar filtracin a travs de
membranas de dimetro
especifico.
 Cromatografa de filtracin en
gel

Tambin llamada comatografa de

exclusin molecular.
Consiste de una fase lquida mvil y una
fase slida estacionaria.
Fase slida estacionaria consiste de un
gel de tamao molecular determinado.
Fase mvil. Acarreara a la mezcla de
protena
 Cromatografa exclusin
molecular
Protenas de alto
peso molecular
salen primero de
la columna
Despus las
protenas de
bajo peso
molecular.
Determinar a cada fraccin:
1. Actividad y
2. concentracin de protena
Usos de la cromatografa de
exclusin molecular