Dra.

Alejandra Quintana
 Tcnicas inmunohistoqumicas

aplicacin de reacciones Ag/Ac

nicas o secuenciales
altamente sensibles
identifican antgenos que se encuentran en tejidos o
clulas
 Antgenos
Sustancia, que inoculada en un animal, es capaz de
desencadenar una respuesta inmunolgica con
expresin humoral y/o celular.

Haptene
Molcula capaz de reaccionar especficamente con
un Ac pero no de inducir su sntesis para lo cual es
necesario que se una con una protena.

Determinante Antignica
Las molculas del Ag no presentan antigenicidad
homognea sino que poseen pequeas reas
responsables de la especificidad que se denominan
determinantes antignicas o epitopes.
 Distintos antgenos pueden compartir una o ms
determinantes antignicas
Existe labilidad de las determinantes antignicas a los
agentes fsicos y qumicos.
Poseen especificidad de rgano y de especie.

RECUPERACION ANTIGENICA
Reaccin antgeno-anticuerpo tpica: los anticuerpos se
unen a grupos o estructuras qumicas especificas
llamados EPITOPES o DETERMINANTES ANTIGENICAS
 Reaccin Antgeno/Anticuerpo tpica: una bacteria
gram-negativa patgena podra tener varios antgenos
o inmungenos (flagelos, fimbrias y pared celular)
 Anticuerpos

Son gamma globulinas (qumicamente

glicoprotenas pertenecientes a la
familia de las Inmunoglobulinas)
Existen 5 clases: IgG (1,2,3,4)
monmero; IgA (1,2) dmero; IgM (1,2)
pentmero; IgD; IgE.
Cada Ig est compuesta de 2 cadenas:
H y L.
H: para la IgG, para la IgM, para la
IgA, para la IgD; para la IgE.
L: o
Para las IHQ vamos a describir la IgG1
Frmula general: 22 o 22
La digestin con papana la divide en dos segmentos:
Fab o fraccin Ac que se une al Ag
Fc o fraccin cristalizable (fija el complemento o se
une a la membrana de ciertas clulas)
En cada cadena de Ig hay reas globulares llamadas
dominios que pueden ser variables (V) o constantes (C)
Los fragmentos Fab poseen dos regiones V. Aqu es
donde se encuentra el sitio de combinacin con el Ag
llamado Paratope.
Existen varias regiones hipervariables se ubican en
los dominios VL y VH.
 VARIACION ISOTIPICA: los genes para las variantes
isotpicas estn todos presentes en el genoma humano
normal. Ej: para las cadenas pesadas y livianas.
VARIACION ALOTIPICA: dentro de una misma especie
existen variaciones genticas (alelos diferentes en
determinados loci). Ej: variacin de algunos AA en las
cadenas pesadas que no se encuentran en todas las
personas. En general los alotipos aparecen como
variantes de las regiones constantes de las cadenas
pesadas.
VARIACION IDIOTIPICA: es la variacin dentro de los
dominios variables (regiones hipervariables).
 La afinidad intrnseca de un anticuerpo reside en la
regin hiperactiva y es determinada por la misma
secuencia de AA que determina la especificidad.

La afinidad funcional, es decir, la avidez que tiene un

Ac por un Ag, depende de cmo se encuentre ese Ag
en el tejido y del propio Ac (tipo de molcula que tenga
unida).
 Interaccin antgeno-anticuerpo

se estabiliza mediante enlaces dbiles, como puentes de

hidrgeno, fuerzas de Van der Waal e interacciones
electrostticas e hidrofbicas.
la suma de todos estos enlaces genera una interaccin
estable entre el lugar de unin del anticuerpo (paratope) y
el lugar de unin del antgeno (eptope).
estas fuerzas son inversamente proporcionales a una
potencia de la distancia entre los grupos interactuantes, lo
que implica que eptope y paratope deben presentar
estructuras complementarias para obtener una energa de
unin suficiente como para resistir la disrupcin
termodinmica.
la suma de estas fuerzas de atraccin y de repulsin se
conoce como afinidad del anticuerpo.
La interaccin Ag-Ac se verifica en tres niveles:
1. La reaccin primaria que consiste en el evento bsico durante el cual
se unen las molculas del Ag con las del Ac en un proceso no visible.
Se unen el epitope del Ag con el paratope del Ac.
2. La reaccin secundaria que es un fenmeno visible como la
aglutinacin o la precipitacin in vitro.
3. La reaccin terciaria es un conjunto de fenmenos biolgicos (in vivo)
y que son consecuencia de las reacciones primarias y secundarias.

Las reacciones IHQ son primarias, se hacen visibles marcando el

anticuerpo secundario.
- Elementos particulados: oro coloidal, ferritina, portena A-oro (ME)
- Fluorocromos: rhodamina, fluoresceina , FICT
- Enzimas: peroxidasa, glucosa-oxidasa, fosfatasa
- Otros: Protena A, avidina-biotina, faloidina, etc.
SENSIBILIDAD:
Si consideramos el Ag: la cantidad mnima de Ag que se pueda localizar.
Si consideramos la tcnica: la cantidad de diagnsticos positivos que se
puedan hacer con distintos mtodos en un nmero fijo de casos. Ej: de un
total de 50 casos, la tcnica A permite el diagnstico de 40 casos positivos
y la B solo 20.
Si consideramos la dilucin de los antisueros marcadores: cuanto mayor
sea la dilucin del antisuero, mayor ser la sensibilidad.

ESPECIFICIDAD:
Que los Acs sean capaces de unirse solo a una sustancia.
Que existan distintos Ags que posean determinantes Ags comunes.
 Anticuerpos policlonales:
Son aquellos que proceden de
distintos clones de linfocitos
B estimulados.

Anticuerpos monoclonales:
Son aquellos que derivan de un
solo clon de linfocitos B y son
especficos para un epitope
determinado, constituyendo
una poblacin homognea.
ANTICUERPOS MONOCLONALES VS POLICLONALES

Anticuerpos Anticuerpos
policlonales (suero) monoclonales
Epitopes que Varios Unico
reconocen
Alta especificidad. Vara No vara.
Especificidad entre animales y entre Alta especificidad
sangras
Afinidad Variable entre sangras Fija

Concentracin media Bajo en cultivo de

Rendimiento 1 mg/ml. Volumen tejidos. Alto (hasta 20
variable (segn mg/ml) en lquido
especie) asctico
Costo relativo Bajo Alto
 ANTICUERPOS POLICLONALES

Cuando se inmuniza un animal con un antgeno y se provoca una

respuesta inmune y aumenta notablemente en el suero del animal la
cantidad de Ig especficas del antgeno empleado.
Esto es la consecuencia de la seleccin clonal de los linfocitos B que
producen anticuerpos contra el antgeno.
Un antgeno puede presentar diferentes eptopes, y cada uno de ellos ser
reconocido por un clon de linfocitos B que producir molculas Igs con una
secuencia caracterstica.
Por ello en el suero de un animal inmunizado se acumulan un nmero
desconocido, posiblemente elevado, de diferentes molculas de Igs
especficas en mayor o menor medida de nuestro antgeno. Se trata de un
suero producido por la accin de sntesis de numerosos clones de linfocitos
B y por ello se ha denominado policlonal.
 El animal ms frecuentemente usado es el conejo, seguido por la cabra,
cerdo, oveja, caballo, cobayo, etc.
Es importante la forma de administracion del Ag: va, dosis, adyuvantes,
nmero de inmnunizaciones, etc., es decir el plan de inmunizacin. Siempre se
saca suero pre-inmune. La primer sangra se hace a los 30 das. Luego el suero
se prueba por ELISA o Aucherloni.
Es importante el tamao del Ag, menor a 10.000 daltons son poco
inmunognicos. Si es muy pequeo hay que pegarle otra molcula: albmina,
tiroglobulina, etc.
A mayor complejidad qumica del Ag, mayor Inmunogenicidad.
Soluciones de Anticuerpos:
Suero completo
Solo Igs
Ac purificados de afinidad
Uso de Ac policlonales:
ventajas: mayor capacidad de deteccin. Mayor sensibilidad de la reaccin.
Se pierden menos con los lavados de la IHQ.
desventajas: son menos especificos.
Anticuerpos
policlonales
 SDS-PAGE WENSTERN BLOT

Especificidad del Ac: SDS-PAGE Y WENSTER-BLOT

 Anticuerpos monoclonales

Son anticuerpos producidos en el laboratorio

por cultivo de un clon celular que produce un
anticuerpo especfico.
 Reaccionan con un epitope especfico del antgeno contra el cual
ha sido originado.
Ventajas:
alta epecificidad
Menos reacciones cruzadas.
Desventajas:
su monoespecificidad hace que reaccione con un solo sitio de la
molcula del Ag y por ende muy pocas molculas del Ac se unen
(tincin ms dbil).
la fijacin puede hacer que el epitope del Ag se altere y la reaccin
se negativiza. Hacer cortes por congelacin.
son ms sensibles al pH y a los iones del buffer diluyente.
 Obtencin de Anticuerpos Monoclonales

1. Inmunizacin de animales contra el antgeno para el que se

desea producir anticuerpos.

2. Fusin de los linfocitos esplnicos con clulas de mieloma

formando hibridomas

3. Seleccin de aquellos hibridomas que sean productores de las

inmunoglobulinas especficas deseadas

4. Clonacin
 Inmunohistoqumica bsica

Velocidad de reaccin: depende de la dilucin ptima del anticuerpo,

as como del tiempo de incubacin y la temperatura.
Ttulo de los anticuerpos: en IHQ el ttulo de Ac puede definirse como
la dilucin ms alta del antisuero (o Ac monoclonal) que resulta en una
coloracin especfica con la menor coloracin de fondo. Un ttulo alto
de Ac policlonales permite una dilucin alta y por ende se diluyen los
Ac no deseados.
Tiempo de incubacin: hay una relacin inversa entre el tiempo de
incubacin y el ttulo del Ac. A mayor ttulo del Ac, menor es el tiempo
de incubacin.
Temperatura de incubacin: la reaccin Ag-Ac se alcanza ms
rpidamente a 37C que a TA. El aumento de la T de incubacin permite
una mayor dilucin del Ac o una disminucin del tiempo de incubacin.
 Inmunofluorescencia
Se usan Ac conjugados con compuestos fluorescentes llamados
fluorocromos. Se unen al Ac 2rio. en forma covalente.

Se usa un MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA que es similar al microscopio

convencional, a excepcin de que la luz incidente que procede de una
potente fuente (UV) capaz de excitar al fluorocromo.

Se pueden observar objetos mas all del lmite de resolucin del

microscopio ptico.
Se pueden ver sustancias especficas (ADN, Ac, etc).
La fluorescencia cesa al cesar el estmulo.
La sustancia a observar absorbe radiacin a una cierta longitud de onda y
emite luz con una longitud de onda mayor que la recibida
Los fluorocromos son sustancias que tienen la
propiedad de emitir un fotn de una longitud de onda
determinada cuando captan (son excitados) por un
fotn incidente de una longitud de onda caracterstica.
Por ejemplo, el isotiocianato de fluorescena tiene un
mximo de absorcin a 490 nm y un mximo de emisin
a 520 nm.
El fluorsforo es el fluorocromo unido covalente mente
a un protena, por ejemplo un anticuerpo.
Uno de los problemas de la utilizacin de fluorocromos
en microscopia de fluorescencia es la prdida de sta
debido a las grandes intensidades de luz empleadas.
Las muestras empleadas en esta tcnica no pueden
observadas durante largos periodos de tiempo debido
a la desaparicin de la fluorescencia ('fluorescence
fading'). Una muestra que ha perdido parte de la
fluorescencia presenta regiones 'oscuras' (como en el
ejemplo).
Se han desarrollado mtodos que permiten reducir este efecto, entre ellos
destacan :
- el uso de reactivos protectores de la fluorescencia ('antifading
reagents')
- el uso de fluorocromos con poco 'fading'
- el empleo de luz de excitacin de menor intensidad
- la reduccin de la concentracin de oxgeno en el espcimen
- el direccionamiento del 100% de la luz hacia el dispositivo de
registro (cmara, pelcula, ect,) para reducir al mximo el tiempo
de exposicin.
- el empleo de mecanismos de medicin de la exposicin ptima
(automtica) para reducir la iluminacin al mximo.
Los reactivos 'antifading' son molculas que aportan al
fluorocromo aquellos electrones que ha perdido por la
emisin fluorescente. Se trata de molculas donadoras
de electrones que deben encontrarse para ser efectivas
en estrecha vecindad a las molculas de fluorocromo.
Adems son especficas de fluorocromo pues los
electrones que pueden donar slo sern donados si se
encuentran en niveles de energa ligeramente
superiores a los propios del fluorocromo en reposo.
LLos reactivos antifading ms empleados son los siguientes :

p-phenylenediamine. Es el reactivo ms efectivo para la conservacin de la

fluorescencia (FITC). Tambin efectivo para la rodamina. Se emplea al 0.1% en glicerol/PBS.
El reactivo se tie de blanco cuando se expone a la luz. Se ha de conservar en la oscuridad.
El contacto con la piel es extremadamente peligroso.

DABCO (1,4-diazabiccyclo-2,2,2-octane). Muy efectivo para la fluorescena, aunque

menor que la p-phenylenediamine. Es menos sensible a la luz y es mucho menos txico.

n-propyl galeate. Es el agente ms efectivo para la rodamina, aunque tambin es

efectivo para la fluorescena. Se emplea al 0.1% en glicerol/PBS.

2-mercaptoethylamine. Se emplea para la observacin de cromosomas y muestras de

DNA teinas con ioduro de propidio (PI), naranja de acridina (AO) o cromomysin A3. Se
emplea al 0.1 mM en Tris-E
 Las tcnicas de inmunofluorescencia se dividen en
inmunofluorescencia directa e indirecta

Inmunofluorescencia directa. Son las que emplean

anticuerpos a los que se ha conjugado directamente un
fluorocromo.

Inmunofluorescencia indirecta. En estas tcnicas el

anticuerpo que reconoce el antgeno no est marcado sino
que se utiliza un segundo anticuerpo conjugado con el
fluorocromo y dirigido contra la especie del primero. Una
variante de estas tcnicas es la que utiliza el primer
anticuerpo conjugado con biotina y posteriormente se aade
avidina o estreptavidina conjugada con el fluorocromo.
 ALTERNATIVAS

de complemento: el sistema del complemento se

une al Ac primario. El Ac 2rio es contra una
fraccin del complemento. Modificacin de la
tcnica indirecta.
de doble marcacin: determinacin de 2 Ags
distintos simultneamente o secuencialmente.
IL-1 in Activated
Mouse T cells.
Indirect
Immunofluoresce
nt staining of IL-
1 producing
activated mouse
T cells.
 Clulas epiteliales , triple coloracin: ncleo (azul),
microtubulos (verdes), actina (rojo). 200X (izq.) y 1000X (der.).

AUTOFLUORESCENCIA