UNIVERSIDAD PARTICULAR DE CHICLAYO

FACULTAD DE MEDICINA

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

ASIGNATURA DE GENTICA I

APLICACIN DE SONDAS GNICAS

EN EL DIAGNSTICO MEDICO
ESTUDIANTES:

Merino Avendao Lucia

Tullume Nevado Roxana

Vallejos Gonzles, Sharon Luciana

Zapata Paredes, Esteban Anthony

 SONDAS GNICAS

Que es una sonda

gnica?
Es una copia fiel Una vez que la
Sonda es una de un gen o de un sonda se une a la
molculas de ADN fragmento de secuencia diana
o ARN homologa ARN o ADN y se
se detecta y
a una secuencia unir cuantifica. La
de ARN o ADN exclusivamente deteccin solo es
diana, con la que esa secuencia de
posible si la
hibrida de forma la que se copia. sonda se ha
estable y
especifica. especificidad de marcado con un
la sonda. grupo detectable.
 TIPOS DE SONDAS:

Sondas de DNA de doble cadena. Pueden ser preparadas utilizando

tcnicas como nick translation, random priming o PCR, en las cuales el
nucletido marcado es incorporado. Estas sondas pueden ser
desnaturalizadas antes de usarse. Cuando se usan para detectar una
cadena simple como mRNA, estas son menos sensibles debido a que la
concentracin de la sonda marcada es reducida.

Sondas de DNA de cadena simple (largas). Pueden ser preparadas utilizando

PCR con un nucletido marcado. ste es el ms usado porque es ms fcil
de llevar a cabo y las marcas pueden sintetizarse con poca cantidad de
material.

Sondas de RNA de cadena sencilla. Pueden ser

sintetizadas por el uso de una RNA polimerasa (SP6,
T7 o T3 RNA polimerasa). La secuencia de la sonda es
clonada en un vector que flanquear dos sitios
distintos de iniciacin.
 CLASES DE MARCAJE PARA
VISUALIZACIN DE LAS MOLCULAS
DIANAS:
Radiactividad:
Se puede marcar radiactivamente la sonda utilizado
nucletidos que tengan alguno de sus tomos con un
istopo radiactivo.
El istopo ms utilizado es el P32, con alta actividad
especfica (9200 Ci/mmol puro) y emite partculas de alta
energa (1'7 MeV) por lo que sondas marcadas con este
elemento tienen un elevado rendimiento y sensibilidad.

Inmunolgico:
Las sondas se marcan utilizando nucletidos que llevan
unida una molcula (digoxigenina), a la solucin se le
aaden anticuerpos especficos que se unen a esa
molcula; y estos anticuerpos llevan asociado un
compuesto luminiscente o fluorescente (como el CDP-
Star) que deja impronta fotografa.
PREPARACIN DE LA SONDA

Para sondas de cadena

sencilla, se debe usar la
secuencia reversa
complementaria. Cuando las
sondas son sintetizadas por
transcripcin, involucra
generar mRNA del gen
endgeno. Cuando se disean
los oligos marcados, es
importante recordar que la
secuencia anti-sentido es la
hebra complementaria
reversa de la cadena lder y
debe ser leda de 5 a 3.
En general es preferible usar
sondas especficas, ya que
esto garantiza una buena
hibridacin.
 El diseo de la
La
sonda:
hibridacin
Se necesitan dos
entrecruzada utiliza
elecciones ms para la
sondas largas (>100 pb)
preparacin de la sonda:
usadas bajo condiciones Para sondas pequeas
el tipo de cidos
selectivas especialmente (oligonucletidos de 20-
nucleicos y la marca que
despus de la digestin 30 pb) es muy probable
se incorpora en la sonda.
con nucleasas, ya que que algn gen distinto al
Algunos mtodos
una sonda adems de de inters tenga una alternativos estn
homloga, debe ser lo secuencia idntica. disponibles para la
suficientemente amplia
sntesis de la sonda.
para llevar a cabo la
hibridacin.
 Eleccin de la sonda:

Las sondas largas de cadena simple (RNA o DNA)

proporcionan una alta sensibilidad en la deteccin de
cadena sencilla.

Para estudios de mRNAs estrechamente relacionados,

las sondas especficas, pueden ser obtenidas por
sntesis de oligonucletidos. Se disean primers que
sern usados para la amplificacin del fragmento
deseado de DNA en el PCR. Estos fragmentos pueden
ser clonados y usados para sintetizar cadenas dobles
o sencillas de DNA o RNA.

 Tamao de la sonda:

Sondas de ADN, sintetizadas

Sondas marcadas por random Primera que pueden ser
por Nick translation, el largo
priming el tamao est elegidos para determinar el
esta determinado por la
determinado por la tamao de la sonda sintetizada
cantidad de DNasa en la
concentracin del primer. por PCR.
reaccin.

Sondas largas de ARN son parcialmente

Sondas largas de ADN pueden
ser cortadas parcialmente por
incubacin a altas
temperaturas.
cortadas por hidrolisis alcalina limitada.
Si el tamao de la sonda es cortada por
hidrolisis hay que revisar el tamao de la
sonda, porque si esta es muy pequea,
esta no hibridara bajo condiciones
selectivas estndar, dando una bajo
seal.
 UTILIZACIN DE SONDAS EN EL DIAGNOSTICO
MEDICO:

Sondas especficas de un
locus:
FISH puede usarse
sobre clulas en
Depende del
metafase para
sndrome en concreto.
Estas sondas se detectar
En algunos, la sonda
hibridan a una regin microdeleciones
es especfica para el
particular de un gen. especficas o para
gen defectuoso, como
Esta sonda es til identificar material
en el Sndrome de
cuando se ha aislado extra de origen
Williams, donde se ha
una pequea parte de desconocido. El
encontrado una
un gen y se quiere nmero de
delecin en el gen de
averiguar en qu sndromes de
la elastina en el 96%
cromosoma se microdelecin
de los pacientes con
encuentra. diagnosticados por
diagnstico
FISH est
confirmado.
aumentando con
rapidez.
 Sndromes de Microdelecin Diagnosticables
mediante FISH

Sndrome de Williams Beuren:

El sndrome de Williams-Beuren
generalmente es causado por una delecin
hemicigota de entre 1.5 a 1.8Mb que
involucra por lo menos 25 genes en
7q11.23. La sonda MD7q11.23 detecta
cualquiera de estas variantes de la delecin
abarcando genes crticos como Elastina,
LIMK1 y WBSCR1 entre otros. Cuenta con
un control en centrmero de cromosoma 7.
 Sndrome de Wolf-Hirschhorn.

La regin crtica del Sndrome de

microdelecin Wolf-Hirschhorn se
encuentra en 4p16. El genotipo-fenotipo
de este sndrome se correlaciona con el
tamao de la regin delecionada
(deleciones menores a 3.5Mb resultan en
fenotipos sin malformaciones fsicas. En el
95% de los casos estas microdeleciones
pueden ser detectadas por FISH con
sondas especficas.
 Sndrome de Prader-Willi/Angelman.

Los desrdenes genmicos de imprinting conocidos

como Prader-Willi / Angelman estn asociados a
alteraciones genmicas de la regin 15q11-q13.
Aproximadamente el 70% de los pacientes
presentan una microdelecin intersticial de 5-7Mb
en esta regin. LIVe ofrece dos kits con sondas para
la regin 15q11-q13 que hibridan sobre genes
claves cercanos a los 3 puntos de rupturas (BP1, 2,
y 3) eventualmente involucrados en los sndromes
de Prader Willi / Angelman. Estas sondas estn
diseadas para examinar ms de una regin por
vez, maximizando la definicin del anlisis. 15q26.3
 Sndrome de Smith-Magenis

Todas las deleciones en 17p11.2 asociadas con el

sndrome de Smith Magenis (SMS) incluyen la
delecin del gen RAI1. Por otro lado, estudios
recientes detectaron que otros genes dentro de la
misma regin contribuyen a las caractersticas
variables y la severidad general de este sndrome.
La sonda LIVe 17p11.2 est diseada para
detectar esta delecin con alta eficacia ya que no
solamente abarca genes crticos de la regin sino
que incluye especficamente el gen RAI1. Como
control de reaccin se incluye la sonda
Centromrica 17.
 Sndromes de Microamplificacin
Diagnosticables mediante FISH
Charcot Marie-Tooth.
Entre el 70-80% de todos los casos de CMT
tipo 1 son de la variante A (CMT1A) e
involucra anomalas en el gen PMP22. Los
casos de CMT1A son causados por la
duplicacin de una regin de 1.5Mb en la
regin 17p12 que contiene al gen PMP22. El
producto recproco de esta duplicacin es una
delecin del mismo tamao que causa una
neuropata hereditaria denominada HNPP.
 APP (Alzheimer).

Estudios recientes han detectado que la

duplicacin del gen APP (Amyloid Precursor Protein)
en el cromosoma 21 est relacionado con la
aparicin temprana de la enfermedad de
Alzheimer. Una duplicacin de entre 0.58 y 6.37Mb
se encontr en pacientes con abundantes
depsitos de peptidos -amiloides. Se ha
comprobado que sondas de FISH especficas para
el locus APP detectan correctamente esta
duplicacin. LIVe ofrece la sonda 21q21.3 que
hibrida completamente sobre el locus APP. Como
control de reaccin est acompaada por 21q22.3.
 Sondas de enumeracin: (EN)

Las sondas de Enumeracin cromosmica son

sondas de DNA especficas para regiones
pericentromricas. Debido a que no involucran
ningn tipo de secuencias satelitales su
especificidad es muy alta an en condiciones de
baja astringencia. En interfases generan seales
definidas y de menor tamao que las clsicas
sondas satelitales, disminuyendo notablemente
la superposicin de seales. Todas las sondas EN
estn disponibles en fluorocromo rojo o verde

 Sondas Telmero-Especficas (STM):

El telmero es el final de cada

cromosoma eucariota. Dos de las
principales funciones de un telmero son
evitar la prdida de DNA como
consecuencia de la replicacin y prevenir
interacciones con los telmeros de otros
cromosomas. As, estas estructuras
juegan un papel principal en el
mantenimiento de la estabilidad
cromosmica.
 Sonda de Pintado Cromosmico Total
(PCT):

Las sondas de pintado cromosmico total

abarcan completamente el cromosoma
blanco generando una seal de
intensidad entre media-alta y alta. Estas
sondas pueden ser mezcladas con
cualquier otra sonda de LIVe sin que esto
disminuya su intensidad o especificidad.
Todas las sondas PCT estn disponibles
en fluorocromo rojo o verde.
 Sondas oncolgicas:

ESTUDIOS ONCO-HEMATOLOGICOS:

Cncer: tumores slidos:

ADVERTENCIA: Las Biopsias para ser usadas con la

tcnica de FISH debern ser extradas e
inmediatamente puestas a fijar en Formol durante 24
a 48 horas antes de ser includas en Parafina.
Fijaciones con Glutaraldehdos no son recomendadas.