Introduccin

La nica prevencin disponibles contra la tuberculosis (TB) es elMycobacterium

bovisBCG, que es eficaz contra las formas miliares y meningitis de TB en
nios;Sin embargo, su eficacia vara mucho entre los adultos, y, como
resultado, la tuberculosis es la segunda causa principal de muerte por un agente
infeccioso en todo el mundo.

Clsicamente, las clulas Th1 juegan un papel importante en el control de la TB.

Recientemente se demostr que IL-12 es crucial para que clulas TCD8+ y

clulas cebadas productoras de INF-y se comporten como efectoras y de
memoria ante la infeccin de M. Tuberculosis.

Algunas de las vacunas contra la tuberculosis que se estn experimentando

actualmente en ensayos clnicos han demostrado un papel importante de
proteccin por clulas Th17.
 MQ

DC
IL-17 Neutrfilos IL-1b TH1-TH17

NK
IL-22 + IL-23 (CD8)
LB
 Hiptesis Objetivos
El papel de los Se utilizar una
Neutrfilos en la vacuna que es capaz
induccin de de inducir Th1 y Th17
respuesta especificas especficos de
tipo Th1 y Th17 ante respuestas de clulas
la vacunacin contra T.
M.tuberculosis
ofrecer proteccin al
husped
 Materiales y mtodos
Preparacin de la vacuna rCDMx.

El mc2-CMX vacuna se diluy a 1 108UFC / ml en PBS con 0,05% de

Tween 80 (PBST).
Despus de la purificacin de protenas, lipopolisacridos (LPS) se elimin
utilizando la ToxinEraserTMkit de eliminacin de endotoxina (GenScript).

Animales
Ratones C57BL/6, Knockout a gen IL-22 , otros a IL-17 y IL- 23. todos ellos
de 8 semanas de edad.

Esquema de vacunacin
El C57BL / 6 (n= 12), IL-17 KO (n= 12), e IL-22 KO (n= 12).
Los ratones fueron vacunados por va subcutnea con 100 ul (10 7CFU) de
mc2-CMX
 Infeccin M.tuberculosis
Los cultivos deM. tuberculosis(H37Rv) en 7H9 que contena 0,05% de
Tween 80 y OADC se hicieron crecer hasta fase semilogartmica, y las
alcuotas se congelaron en 20% de glicerol a -80 C.La concentracin del
lote micobacterias se determin 30 das ms tarde en placas y contando el
UFC de viales.

En el da del desafo, se descongelaron alcuotas, la concentracin se

ajust a 106CFU / ml, y 100uL se inyecta por va intravenosa en la vena
lateral de la cola.Un da despus de la infeccin, un animal de cada grupo
fue sacrificado, y los pulmones se homogeneizaron y se sembraron en
7H11 suplementado con medios OADC para determinar la carga bacteriana
inicial.La carga media de bacterias en los pulmones en el da uno fue 3,4
104CFU.

Treinta das despus del desafo, los animales fueron sacrificados y los
lbulos pulmonares craneales y medial derecha se homogeneizaron para
verificar la carga bacteriana

 Respuesta especfica CD4 T inmunes a CMX
La respuesta inmune especfica inducida por la vacunacin fue
probado antes del desafo (15 das despus del refuerzo) y 30
das despus de la infeccin porM.tuberculosis ..Seis animales
de cada grupo se sacrificaron por dislocacin cervical y se
extirparon los bazos para evaluar las respuestas inmunes
especficas.
La suspensin de clulas individuales obtenido despus del
paso a travs de un colador 70 um (BD Biosciences) se trat
con tampn de lisis (0,15 M NH 4Cl y 10 mM de KHCO3).
La suspensin se ajusto a 1 x106 /ml en 200ul
CD4-FITC
IL-17-PerCP
INFy- PE
 Evaluacin de neutrfilos
Los neutrfilos de los animales vacunados se evalu
30 das despus del desafo conM. Tuberculosis, Se
obtuvieron los esplenocitos .
Las clulas se incubaron durante 30 minutos con
APC-conjugado anti-GR1 , PerCP-conjugado anti-
CD14, anticuerpos anti-CD11b conjugado con PE
anti-CD11c y conjugados con FITC .
 Deplecin de neutrfilos

C57BL/6

6 Vacunado Mc2 CMX CFU/animal

12 200ul con Ly6G
6 PBS

6 No marcado con Ly6G,

Vacunado Mc2 CMX CFU/animal
12 IgG2a
6 PBS

6 No marcado con Ly6G, No con

Vacunado Mc2 CMX CFU/animal
12 PBS
6 PBS
3 3

46 das reto con

3 31 das Citometra 3 Citometra
M.tuberculosis
105CFU /ratn
3 3
 Evaluacin de dao
tisular
Los tejidos desde el sitio de la vacunacin y lbulos
pulmonares caudales se recogieron y se fijaron en 10% de
paraformaldehdo.

Tejidos fijados se cortaron a 5 micrmetro de espesor se

colocaron sobre portaobjetos, se tieron con hematoxilina y
eosina (H & E), y se evaluaron usando un microscopio
ptico
 Anlisis estadstico
Las comparaciones entre los grupos se evaluaron
mediante ANOVA seguido de la prueba de Mann-
WhitneyU.p<0,05 se consider estadsticamente
significativo.
 Resultados
Para evaluar si IL-17 e IL-22 estaban
involucrados en el recuerdo de la
respuesta inmune generada por el
mc 2 -CMX vacuna despus de M.
tuberculosis desafo, el de tipo salvaje,
los ratones IL-17 KO y IL-22 KO
fueron vacunados con mc 2 -CMX y
fueron infectados con M.
tuberculosis 30 das ms tarde.
Conclusin
Este trabajo demuestra por primera vez que los neutrfilos son importantes
para la induccin especfica de las clulas Th1 y Th17 en respuesta a una
vacuna contra la M. tuberculosis .