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Mtodos

cromatogrficos de
separao

Prof. Dr. Ricardo Serudo


Definio

um mtodo fsico-qumico de separao dos componentes de uma mistura por interao entre uma fase
estacionria e uma fase mvel.

Fase Estacionria: slido (ou lquido impregnado com slido) que permanece dentro da
coluna de separao.

Fase Mvel: solvente (gs ou lquido) que se move atravs da coluna, carregando os
solutos.
Histrico
M. TSWEET (1903): Separao de misturas de pigmentos vegetais em colunas recheadas com adsorventes
slidos e solventes variados.
ter de
petrleo
mistura de
pigmentos

CaCO3 pigmentos
separados

Cromatografia =
kroma [cor] + graph [escrever]
(grego)
Princpio
Classificao

1-De acordo com o sistema cromatogrfico

Em Coluna

Cromatografia Lquida
Cromatografia Gasosa
Cromatografia Supercrtica

Planar

Cromatografia em Camada Delgada (CDC)


Cromatografia em Papel (CP)
Classificao

2-De acordo com a Fase Mvel


Utilizao de Gs
Cromatografia Gasosa (CG)
Cromatografia Gasosa de Alta Resoluo (CGAR)

Utilizao de Lquido
Cromatografia Lquida Clssica (CLC)
Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE)

Utilizao de Gs Pressurizado
Cromatografia Supercrtica (CSC)
Classificao

3-De acordo com a Fase Estacionria


Lquida
Slida
Quimicamente Ligadas

4-De acordo com o Modo de Separao


Por adsoro
Por partio
Por troca inica
Mecanismos de separao
Classificao

CROMATOGRAFIA

Planar Em coluna

L Gs Fludo supercrtico Lquido


Tcnica
Fase Mvel
Fase Estacionria L FL L FL
L FL L FL
Tipos de Cromatografia
S
S S

CP CCD CGL CGFL CSS CSFL CLL

CCD CGS CLS CE

CLFL CTI CB
Cromatografia em Papel

- Cromatografia Planar Lquido-lquido


- Princpio: partio relaciona a diferena de solubilidades dos
componentes de uma mistura, na fase mvel e fase estacionria;
- Tipos: ascendente, descendente, bidimensional, circular
- Anlise qualitativa: Rf (fator de reteno);
Rf = distncia percorrida pela substncia
distncia percorrida pela fase mvel
Cromatografia em camada delgada

Mtodo rpido (20-40 min.)


Uso de diversos agentes cromognicos
Maior sensibilidade que C.P. (10-9 g)
Grande gama de compostos pode ser analisada
Mtodo simples e barato
F.M. - sistema de solventes
F.E - Adsorventes (slica, alumina, celite, amido)
Mtodos de deteco: fsico-qumicos
Princpio: Adsoro (polaridade)
Cromatografia em coluna

Pode ser tambm chamada de cromatografia


lquida clssica.
FE slica e alumina;
FM eluente;
PRINCPIO: adsoro
Cromatografia Gasosa

FASE MVEL

Fase
estacionria
injeo separao eluio

DETECTOR
Cromatografia Gasosa

Cromatografia
Gs-Slido (CGS)
Slida
FE slida com uma grande rea superficial e a
Em CG a FE separao baseia-se em mecanismos de
pode ser: adsoro das substncias neste slido.

Cromatografia
Lquida Gs-Lquido (CGL)

FE lquida pouco voltil recobrindo um suporte


slido ou as paredes da coluna capilar. A
separao baseia-se em mecanismo de partio
das substncias entre a fase lquida e gasosa.
Cromatografia Gasosa

Vantagens
Rapidez
Alto poder de separao Desvantagens

Separao de vrias classes de Amostras volteis


compostos em uma anlise Compostos termicamente estveis
Sensibilidade (ppm - ppb) Tcnicas auxiliares p/ identificao
Facilidade de registrar dados
Variedade de detetores
(especificidade)
Cromatografia Gasosa (Aplicaes)

Quais misturas podem ser separadas por CG ?

(para uma substncia qualquer poder ser arrastada por um fluxo de um gs ela deve se
dissolver - pelo menos parcialmente - nesse gs)

Misturas cujos constituintes sejam


VOLTEIS (evaporveis)
DE FORMA GERAL:
CG aplicvel para separao e anlise de misturas cujos constituintes tenham PONTOS DE
EBULIO de at 300oC e que sejam termicamente estveis.
Cromatografia Gasosa (Aplicaes)

Ambiental
Pesticidas, organoclorados e PCBs
Hidrocarbonetos
Aminas e fenis
Alimentos
Anlise de cidos graxos e triglicerdeos
Anlise de compostos volteis responsveis pelo aroma caracterstico de alimentos
Anlise de acares e aminocidos
Farmacutica
Qumica Forense/Toxicologia
Doping
Metablitos de drogas
Qumica Industrial
Petroqumica
Cromatgrafo de Fase Gasosa:
Cromatografia Gasosa

1 - Reservatrio de Gs
1 6 e Controles de Vazo /
Presso.
2
2 - Injetor (Vaporizador)
de Amostra.
3 - Coluna
5 Cromatogrfica e
4 Forno da Coluna.
4 - Detector.
5 - Eletrnica de
Tratamento de Sinal.
6 - Registro
3
Cromatografia Gasosa
Gs de Arraste

Fase Mvel em CG: NO interage com a amostra - apenas a carrega atravs da coluna. Assim usualmente
referida como GS DE ARRASTE

INERTE No deve reagir com a amostra, fase estacionria ou superfcies do


instrumento.
PURO Deve ser isento de impurezas que possam degradar a fase estacionria.

oxida / hidroliza algumas FE


Impurezas tpicas em gases e seus H2O, O2 incompatveis com DCE
efeitos:
hidrocarbonetos rudo no sinal de DIC
Gs de Arraste

CUSTO Gases de altssima pureza podem ser muito caros.

A = 99,995 % (4.5)
CUSTO

C
B = 99,999 % (5.0)
B
A C = 99,9999 % (6.0)
PUREZA

COMPATVEL COM DETECTOR Cada detector demanda um gs


de arraste especfico para melhor funcionamento.
Linha de Gs de Arraste

3
4 6
1 - Cilindro de Gs
2 - Regulador de Presso Primrio
2 3 - Traps para eliminar impurezas do
gs
1 4 - Regulador de Presso Secundrio
5 - Regulador de Vazo
6 - Medidor de Vazo (Rotmetro)
5
Injetor

1
2

3 1 - Septo (silicone)
2 - Alimentao de gs de arraste)
4 3 - Bloco metlico aquecido
4 - Ponta da coluna cromatogrfica
Injetor
TEMPERATURA DO INJETOR

Deve ser suficientemente elevada para que a amostra vaporize


imediatamente, mas sem ocasionar a sua decomposio.
Regra Geral: Tinj = 50oC acima da temperatura de ebulio do componente menos voltil

VOLUME INJETADO Depende do tipo de coluna e do estado fsico da amostra


Amostras Amostras
COLUNA Lquidas Gasosas

empacotada 0,2 L ... 20 L 0,1 ml ... 50 mL


= 3,2 mm (1/4)

capilar 0,01 L ... 3 L 0,001 ml ... 0,1 mL


= 0,25 mm

Slidos: convencionalmente se dissolve em um solvente adequado e injeta-


se a soluo
Microseringa

Microseringa de 10 L

mbolo agulha (inox 316)

corpo (pirex)
Colunas

EMPACOTADA CAPILAR
= 3 a 6 mm = 0,1 a 0,5 mm
L = 0,5 m a 5 m L = 5 m a 100 m
Recheada com slido pul-verizado (FE slida Paredes internas recober-tas com um
ou FE lquida depositada sobre as partculas filme fino (fra-o de m) de FE lquida
do recheio) ou slida
Colunas

Alm da interao com a FE, o tempo que um analito demora para percorrer a
coluna depende de sua PRESSO DE VAPOR (p0).

Temperatura Presso Velocidade


da de de
coluna vapor migrao

ANALITO ELUI MAIS RAPIDAMENTE


(MENOR RETENO)
Colunas

TEMPERATURA DA COLUNA
CONTROLE CONFIVEL DA
TEMPERATURA DA COLUNA
ESSENCIAL PARA OBTER
BOA SEPARAO EM CG
Detectores

Dispositivos que examinam continuamente o material eludo, gerando sinal quando da


passagem de substncias que no o gs de arraste
Grfico Sinal x
Tempo =
CROMATOGRAM
A
Idealmente: cada
substncia
separada aparece
como um PICO no
cromatograma.
Detectores

UNIVERSAIS: Geram sinal para qualquer substncia eluda.

SELETIVOS: Detectam apenas substncias com determinada


propriedade fsico-qumica.

ESPECFICOS: Detectam substncias que possuam determinado


elemento ou grupo funcional em suas estruturas
~ 60 detectores j usados em CG

~ 15 equipam cromatgrafos comerciais

4 respondem pela maior parte das aplicaes

DCT TCD DIC FID


Detector por Detector por
Condutividade Ionizao em
Trmica Chama

DCE ECD EM MS
Detector por Detector Es-
Captura de pectromtrico de
Eletrons Massas
Detectores

DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TRMICA (DCT OU TCD)

um Detector de 2 canais
mede a diferena, em Condutividade Trmica , entre o Gs de Arraste (Referncia) e o do
Gs de Arraste + Amostra (analtico)
possui 2 pares de filamentos, 1 em cada canal , formando uma ponte.
As vazes dos 2 canais devem ser praticamente iguais
A presena de um componente, dissolvido no Gs de arraste, ao atingir o canal analtico
muda a resistncia deste filamento , provocando um desequilbrio na ponte que gera um
sinal proporcional a quantidade deste
A sua sensibilidade depende da corrente do Filamento , concentrao dos componentes e
da diferena da Condutividade Trmica entre o Gs de arraste e o componente .
TCD
DETECTOR POR IONIZAO EM CHAMA (DIC OU FID) .

baseia-se no princpio de que a concentrao de um composto


diretamente proporcional a concentrao das partculas ionizadas presentes
no mesmo
O Gs de arraste e os componentes que eluem da Coluna atingem a chama .
Esta ioniza (queima) as molculas orgnicas presentes na corrente gasosa .
As partculas ionizadas, entre os eletrodos, gera uma corrente que medida
atravs de uma resistncia
FID

Collector
Flame jet

Air in

Hydrogen in

Column connection
DETECTOR POR CAPTURA DE ELTRONS (DCE OU ECD)

um Detector seletivo, especfico para anlises de Compostos Eletroflicos (como os


Halognios nos Clorados) .
A cela do ECD revestida internamente por uma lmina do istopo radioativo de Ni-
63.
As Partculas Beta emitidas pelo istopo ionizam o Carrier e os ons e Eltrons
resultantes migram para o anodo coletor por influencia de uma voltagem polarizada
pulsante , aplicada entre a fonte e o coletor
A freqncia de pulsao controlada para manter a corrente constante e a geradora
do sinal analtico .
um Detector no destrutivo e altamente sensvel, ideal para anlise de pesticidas e
agrotxicos clorados
ECD

Collector

63Nickel foil

Make-up gas in

Column connection
DETECTOR POR ESPECTROMETRIA DE MASSAS

A GC/MS uma tcnica analtica , tambm bastante conhecida, que visa identificar
positivamente e ou quantificar os componentes de uma mistura .

Os componentes da amostra, previamente separados no GC, so transferidas p/ o MS,


atravs de uma linha de transferncia.

No MS ocorre a fragmentao da molcula e a deteco, possibilitando ao usurio o


detalhamento da estrutura e o peso molecular do composto.

Utilizando uma biblioteca especfica podemos identificar positivamente o composto, baseado


na abundncia dos seus fragmentos (ions) .
MS
Espectro de Massa (TBT)
Cromatografia Lquida

Esquema para CLC:

Preparo da coluna

Aplica-se a amostra

Eluente

Deteco e quantificao (espectroscopia ou gravimetria)


Cromatografia Lquida

Coluna fechada

Injeo de amostra
Esquema para CLAE:
Detector

Cromatogramas
Cromatografia Lquida de Alta Resoluo:

Caractersticas da Fase Mvel usada em CLAE:


Alto grau de pureza ou de fcil purificao;
Dissolver a amostra sem decompor os seus
componentes;
No decompor ou dissolver a FE;
Ter baixa viscosidade;
Ser compatvel ao detector utilizado;
Ter polaridade adequada para permitir uma separao
dos componentes da amostra.
Cromatografia Lquida de Alta Resoluo

Tipos de amostras que podem ser analisadas por CLAE:


aminocidos;
explosivos;
lipdeos polares;
metablicos de animais e plantas;
pigmentos de plantas;
produtos farmacuticos;
protenas;
tintas.
Comparao entre CG e CLAE

FATOR CG CLAE
Requisitos para amostra Amostra voltil ou derivatizvel, Amostra solvel na fase mvel.
termicamente estvel na temperatura
de operao do sistema
cromatogrfico.

Tipos de amostras Gases, lquidos ou slidos MM: 2 a Lquidos e slidos, inicos ou


1200 covalentes. MM: 32 a 4.000.000

Quantidades mnimas 10-12g 10-9


detectveis
Tempo de anlise Minutos at poucas horas Minutos at poucas horas

Capacidade analtica Excelente, separao de amostras Excelente, separao de amostras


com at 200 componentes. com at 50 componentes.

Tempo de treinamento para um Cerca de 3 meses. Pelo menos 6 meses.


operador
Eficincia dos sistemas cromatogrficos:

A migrao de um analito
pela coluna provoca
inevitavelmente o
alargamento da sua
TEMPO banda:
Efeitos do alargamento excessivo de picos:
Separao deficiente de analitos Picos mais largos e menos
com retenes prximas. intensos = menor detectabilidade

EFICINCIA Capacidade de eluio com o mnimo de


disperso do analito.
Anlise Qualitativa:

Identificao individual das


Aplicaes espcies contidas na amostra
Qualitativas de
Determinao da identidade da
CG
amostra propriamente dita

Fontes de Informaes Qualitativas


RETENO Uso de dados de reteno de um analito
para sua identificao
DETECO Detectores que fornecem informaes
estruturais sobre as substncias eludas
Para anlise qualitativa confivel por CG recomendvel
combinao de dados provenientes de pelo menos duas
fontes
Anlise Qualitativa: (tempos de reteno)

Interaes analito / FE
tR = f Presso de vapor do analito
Condies operacionais
Fixas as condies operacionais, o tempo de reteno ajustado de
um analito uma constante

AMOSTRA

Comparao de
cromatogramas da
amostra e de uma
PADRO soluo padro do
analito suspeito
Anlise Qualitativa: (mtodos de deteco)
Mtodos de deteco que fornecem informaes qualitativas sobre os
analitos eludos:

Cromatografia Gasosa com Deteco


Espectromtrica de Massas (CG-EM)

Cromatografia Gasosa com Deteco


Espectromtrica por Emisso Atmica (CG-EA)

Cromatografia Gasosa com Deteco


Espectromtrica por Absoro no Infra-Vermelho
(CG-EIV)
Identificao muito confivel quando combinados a tcnicas de
identificao baseadas em reteno
Padres cromatogrficos:

Externos (Identificao)

Internos (Quantificao)
Padres
Surogates (Recuperao)
Controle de Qualidade dos dados:

Programas de Intercalibrao

Materiais de referncia
Cromatogramas:
RT: 6.00 - 15.00
10.43
100

95

90
12.91
85

80

75

70

65

60
Abundncia relativa

55

50

45
10.15
40

35
11.78
30

25 11.34

20

15

10
12.51
5
7.08 8.01 8.82 9.51 10.67 13.69 14.39 14.75
0
6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Tempo (min)
Cromatogramas: