Biofilm formation by Vibrio parahaemolyticus on

food and food contact surfaces increases with rise

in temperature

TP 119 Crescimento e Metabolismo das Bactrias

Professora Dra. Aline Crucello

Miriam Gonalves Marquezini

2017
RESUMO
 INTRODUO
Vibrio parahaemolyticus
Bastonete curvo
Gram negativo
Aerbio facultativo
Flagelo nico

Habitat
gua doce
gua salgada
 INTRODUO
Alta frequncia na sia (MFDS, 2014).
Coria, China e Japo

Coria: 9 a 16% dos casos de intoxicao relatados

Xu, Wang, Sun, Liu e Li (2013)

Biofilme em superfcies subaquticas
Frutos do mar in natura
 INTRODUO
Biofilme (Jahid & Ha, 2012; Mizan, Jahid & Ha, 2015)
Estruturas arquitetnicas complexas
Dispostas em superfcies
Interfaces biticas e abiticas
Interaes entre populaes
Contedo:
Exopolissacardeos
Estruturas tridimensionais
Auto-orgnizadas
Fenotpicas e genotpicas
 INTRODUO

Processo de adeso e formao de biofilmes em superfcies, dividido em quatro etapas: a) pr-adeso do microrganismo no
substrato; b) adeso reversvel; c) adeso irreversvel com produo e EPS; d) incorporao de novos grupos de microrganismos
e e) maturao do biofilme e incio da liberao de clulas planctnicas
Fonte: Adaptado de Forsythe (2002)
 INTRODUO

Quorum sensing

Comunicao celular
Intra e interespcies

Compostos qumicos
Autoindutores (Ais)

Regulao da populao
 OBJETIVO

O presente estudo investigou a formao de biofilme de

V. parahaemolyticus em cupons de ao inoxidvel, caranguejo e
camaro em vrias temperaturas, utilizando o mtodo do ndice
de formao de biofilmes (BFI) em placas de microtitulao.
 MATERIAIS E MTODOS
Estirpes bacterianas e condies de crescimento

V. parahaemolyticus
KCTC 2471 (isolado de um caso de intoxicao alimentar)
KCTC 2729 (isolado de um paciente que sofre de "Shirasu
ATCC 33844 (isolado de um paciente com intoxicao alimentar)

Estocadas -80C Cocktail

 MATERIAIS E MTODOS
Preparo da cultura padronizada

Ativao Culturas
gar TCBS Padronizadas

Incubao a 30C overnight

Transferncia
Diluio
5mL caldo TSB
Conforme necessrio
+2,5% NaCl

Incubao a 30C overnight

com agitao de 220 RPM

Ressuspenso
Centrifugao
Lavagem Caldo LB+2,5% NaCl
11.000g por 10min
OD 600nm = 1,0
 MATERIAIS E MTODOS
Quantificao da formao de biofilme
Microplacas (Jahid, Lee, Kim e Ha (2013) modificado)

Inoculao Secagem
100l cultura por poo Durante a noite

Incubao 4, 10, 15, 20, 25, 30 ou 37C/72h

Ressuspenso
Densidade ptica
125mL de Etanol 95%
OD 595nm
10 minutos

Colorao
Lavagem Secagem
Cristal violeta 0,1% (p/v)
Imerso em cuba Durante a noite
45 minutos
 MATERIAIS E MTODOS

AB a OD com o Cristal Violeta

CW a OD do branco
GB a OD do crescimento aps 72h
GW a OD do branco aps 72h

BFI < 0,35: sem formao de biofilme

0.35 BFI 0.69: fraco
0.70 BFI 1.09: moderado
BFI > 1.10: forte
 MATERIAIS E MTODOS
Preparao de cupons de ao inoxidvel
Ao inoxidvel
Recortes (2x2x0,1cm)

Inoculao
10mL cultura tubo Falcon

Incubao 4, 10, 15, 20, 25, 30 ou 37C/24h

Transferncia
Quantificao
Placas Petri 55x12mm

Agitao Plaqueamento Incubao

Pina estril Clulas em gar TCBS 24h
 MATERIAIS E MTODOS
Preparo do inculo para as amostras de alimentos

Cultura Ativa
TSB+2,5% NaCl

Centrifugada
11.000g por 10 min a 4C

Resusspenso
caldo PBS
OD600 = 1,0
 MATERIAIS E MTODOS
Preparao de cupons de camaro e caranguejo
Mariscos adquiridos mercearia
Cortados em cupons 2x2cm
Lavados para remover a carne
Dispostos em placas de Petri
Aplicado UV por 30 minutos
Submersos em 10mL de gua fresca
Inoculadas as bactrias na diluio 1:2500
Incubao nas mesmas condies
Transferidos para bolsa nasco
Adicionado 10mL PW
Homogeneizado em Stomacher por 2 min
Quantificao em TCBS
 MATERIAIS E MTODOS
Determinao da Exoprotease
Fluoro Protease (G-Bioscience, St. Louis, MO, EUA)
As culturas foram diludas 1:50 em caldo TSB
Incubadas a 4,10,15, 20, 25, 30, 35 ou 37C por 24h
Centrifugadas a 15.000g por 10 min
50mL de cada temperatura foi adicionado a 100mL do substrato
Incubado a temperatura ambiente por 1h
Medio da fluorescncia
Excitao a 485nm
Ondas de emisso a 530nm
Controle positivo foi usado Tripsina fornecida no kit.
 MATERIAIS E MTODOS
Determinao do Autoindutor-2 (Soni et al., 2008)

Cupons Caranguejo
gua doce BG-11 de
cianobactria

Incubao 4, 10, 15, 20, 25, 30 ou 37C/24h

Centrifugao
15.000g por 10min

Teste Autoindutor 2
Filtrao Leitura da
Estirpe reprte V. harvey
Tuffryn de 0,2 mm
BB170 Luminescncia
 MATERIAIS E MTODOS
Determinao do Autoindutor-2 (Soni et al., 2008)

Bioensaio
Leitura do resutado
100L do tubo Falcon

Cultivo V. harveyi
Com aerao no caldo do
bioensario
Leitura do resutado
100L do tubo Falcon

Incubao 30C durante a noite

Tubo Falcon (50mL)

Diluio Homogeneizao
4,5mL da diluio BB170
BB170: 1:100 em caldo AB 220 rpm por 16h
500L das culturas
 MATERIAIS E MTODOS
Microscopia eletrnica de varredura (MEV)

Cupons
SS, camaro e caranguejo Microscpio Eletrnico
5 kV com uma distncia de
trabalho de 5 mm

Lavados
3 vezes com PBS Revestimento
Platina

Fixao Tratamento Etanol Desidratao

4% de glutaraldedo em 50, 60, 70, 80, 90% - 1X Hexametildisilazano
caldo PBS por 24h 100% - 2X 33, 50, 66 e 100%
 MATERIAIS E MTODOS

Anlise estatstica

Experimento em triplicata
Anlise de varincia unidirecional
Statistical Analysis System (SAS verso 9.2)
P <0,05
 RESULTADOS
Quantificao da formao de biofilme

Formao de biofilme

Biofilme x Temperatura
15 e 37C
4 e 10C

TC processo oscila

V. parahaemolyticus
Wong, Chung e Yu, 2002 4C
Twedt, 1989 5C
Miles, Ross, Olley e McMee parentes, 1997 8,3C
 RESULTADOS
Quantificao da formao de biofilme

Fig. 1. Planktonic cells and biofilm formation on stainless steel (A), shrimp (B), and crab (C) surfaces at various temperatures. The data are presented
as the mean of log values of the bacterial population SEM for three independent replicates. Within each variable, values with different lowercase
letters are significantly different according Duncans multiplerange test (P < 0.05). *Log CFU/cm2 is for the biofilm population, and Log CFU/mL is for
the planktonic cell population.
 RESULTADOS
Determinao da Exoprotease

Exoproteases relacionadas a fatores de virulncia

Khouadja, Lamari, & Bakhrouf, 2013; Mekalanos ,1992.

Temperatura e pH influenciam na regulao gnica

4 a 30C = Aumentou
37C = Reduziu

Temperatura influencia na produo de substncias polimricas

Responsvel pela ligao das clulas
Compromete Formao do biofilme
 RESULTADOS
Determinao do Autoindutor-2
Autoindutores AI-2 influenciaram
Produo de biofilme
Motilidade
Bioluminescncia

O acrscimo de temperatura influenciou a produo de AI-2

30C apresentou aumento significante

Correlao entre:
Produo de biofilme
Produo de exprotease
Produo de AI-2
Fig. 2. Field emission scanning electron micrographs of Vibrio parahaemolyticus biofilm formation on stainless steel (A, B, C), shrimp (D, E, F), and crab (G, H, I) surfaces (5000
magnification and 10,000 magnification), at 4C (A, D, G), 30C (B, E, H), and 37C (C, F, I).
 CONCLUSO
1. Baixas temperaturas podem reduzir a formao de biofilme;

2. Elevao de temperatura potencializa formao de biofilme, virulncia

e quorum em V. parahaemolyticus;

3. Formao de biofilmes em superfcies de mariscos e frutos do mar

aumenta os riscos associados a ingesto destes alimentos e elevar a
contaminao cruzada nestes estabelecimentos;

4. Formao de biofilme a principal causa de intoxicao alimentar em

temperaturas elevadas (25 a 37C);

5. A produo de Exoprotease e AI-2 reduzida a 37C e indica que a

fixao de V. parahaemolyticus afetada pelo ambiente.
 REFERNCIAS

SUO, B.; HE, Y.; TU, S-T; SHI, X. A multiplex real-time polymerase chain
reaction for simultaneous detection of Salmonella spp., Escherichia coli O157,
and Listeria monocytogenes in Meat Products. Foodborne Pathogens and
Disease.2010, v.6, n.6, p.619-628.