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Engenharia Bioqumica

Cintica de reaes
enzimticas
Introduo
O que so enzimas?
protenas catalisadores biolgicos

Obteno
clulas vivas
animais

vegetais

microrganismos

1000 enzimas purificadas de 100.000...

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Enzimas
Funo
catalisar a produo de compostos de interesse

O que catalisar?
baixar Eat
aumentar a taxa de reao
catalisador no consumido

Catalisadores
homogneos x heterogneos

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Enzimas
Catalisadores
homogneos x heterogneos
Protenas
habilidade cataltica
estrutura da protena stio ativo!

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Enzimas
Estrutura
1a., 2a., 3a. e 4a
definem o stio ativo

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Nomenclatura de enzimas
Substrato ou reao + ase
Ex: lipase (lipdeos), protease (protenas), amilase
(amidos); oxiredutase (oxireduo)...
EC (Enzyme Comission IUB International Union
of Biochemistry http://www.iubmb.unibe.ch/ )
EC x.y.z.w onde x a classe principal
1. xido redutases (oxid-red)
2. Transferases (transferncias de grupos funcionais)
3. Hidrolases (reaes de hidrlise)
4. Liases (adies em duplas ligaes)
5. Isomerases (reaes de isomerizao)
6. Ligases (formao de ligaes com clivagem de ATP)
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Nomenclatura de enzimas
O y a subclasse
Tipo de ligao onde age a enzima

O z outra subclasse
Grupo onde a enzima age
Cofator requerido
...

O w um nmero de srie
Ordem na qual a enzima foi adicionada ao
sistema de classificao
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Nomenclatura de enzimas
Oxidoredutases
http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC1/intro.html

Catalisam reaes de oxidao e reduo, usualmente


com coenzimas como NAD+/FAD
Ex:lcool desidrogenase [EC 1.1.1.1]
etanol + NAD+ acetaldedo + NADH
Transferases
http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/EC2/

Catalisam a transferncia de um grupo funcional


Ex: Hexokinase [EC 2.7.1.2]
D-glu + ATP D-glu-6-P + ADP

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Nomenclatura de enzimas
Hidrolases
http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/

Catalisam reaes hidrolticas (adicionam gua em


ligaes C-C)
Ex: Carboxipeptidase A [EC 3.4.17.1]

Liases

http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/EC4/

Adicionam ou removem grupos em C=C


Ex:piruvato descarboxilase [EC 4.1.1.1]
piruvato acetaldedo + CO2
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Nomenclatura de enzimas
Isomerases
http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/EC5/

Catalisam isomerizaes
Maleato isomerase [EC 5.2.1.1]
maleate fumarate

Ligases
http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/EC6/

Condensao de dois substratos com quebra de ATP


Piruvato Carboxilase [EC 6.4.1.1]
PIR + CO2 + ATP OAA + ADP + P

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Atividade enzimtica
Definio de atividade
Reatividade
Medida pela velocidade da reao (taxa de reao ou da
converso substrato em produto)
U = unidade ou UI = unidade internacional
1 U = quantidade de enzima que converte 1 mol de
substrato/min

Atividade especfica
Unidades por mg de protena total

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Atividade enzimtica

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Diferenas entre enzimas e catalisadores qumicos

a) Especificidade: catlise de uma ou um pequeno


nmero de reaes

b) Maiores taxas de reao quando comparada com a


mesma reao catalisada por catalisadores no
biolgicos

c) Condies amenas de reao (T, pH, etc)

d) Molculas sensveis e instveis cuidado no uso

e) Biodegradveis e atxicas

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Mecanismo de reaes enzimticas

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Cintica enzimtica simples
Taxa de reao e como esta afetada por
condies fsicas e qumicas

Informaes sobre o mecanismo da reao


enzimtica e parmetros que caracterizam as
propriedades da enzima

Clculo do tempo de reao, rendimento,


condio tima

Projeto do reator (volume)

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Cintica enzimtica simples
E
S P

rs = -dS/dt

rp = dP/dt

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Cintica enzimtica simples
Como a taxa de reao afetada pela [E], [S] e
[P]??
Medida de taxa inicial em diferentes [S] e [P]

Variao com [E]

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Cintica enzimtica simples
em baixas concentraes
de S substrato a reao
Variao com [S]
de 1a ordem;
medida que S aumenta
a ordem de reao
diminui de 1 at 0;
a velocidade mxima de
reao proporcional a
quantidade de enzima
presente;
em altas concentraes
de S a reao de ordem
zero.
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Modelo Michaelis-Menten

Hipteses:

Formao do complexo ES imediata


Vo, [P]~0
[ES] = constante

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Modelo Michaelis-Menten
Como [ES] = cte

Como K3<<K2 e K1

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Modelo Michaelis-Menten
Total de enzima = cte

Etapa limitante formao de produto

Se toda a enzima participa da reao

Rearranjando obtm-se a Eq. Michaelis Menten

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Modelo Michaelis-Menten
Da eq. Michaelis Menten pode-se tirar

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Modelo Michaelis-Menten
Linearizaes
Lineweaver Burk

nfase a valores de
velocidade baixos obtidos
em baixas concentraes de
substrato

Tangente (Km/vmax) pouco


precisa
v relativamente impreciso
1/vmax mais preciso

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Modelo Michaelis-Menten
Linearizaes
Eadie Hanes

Espalha os valores mais


altos (1/vmax de boa
preciso)
Interseo prxima de 0

Km com erro elevado

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Modelo Michaelis-Menten
Linearizaes
Hofstee

nfase em todos os
pontos: bom Km
Necessita altas [S]
para bom vmx

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Modelo Michaelis-Menten
Como estimar vmx e Km?
Srie de experimentos em batelada [S] e
[E] cte
Estimar a taxa inicial para as curvas de S x t
para [S]
Estratgia:
Determinar vmx pelas eqs 1 ou 2
Voltar ao grfico v x S e achar Km
(Km a [S] onde v=vmax/2)
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Modelo Michaelis-Menten
MAS...

Velocidade da reao enzimtica pode ser modificada


pela presena de outros compostos COFATORES.

Det. v em funo da [S] Ativadores


na presena de diversas Inativadores
concentraes de inibidores Inibidores



AQUI:
Estudo detalhado da Inibio competitiva
cintica de inibio Inibio incompetitiva
Inibio no competitiva
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Inibio
Irreversvel
CN-, gases, metais pesados

Reversvel
Competitiva, incompetitiva, no competitiva

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Inibio competitiva
Inibidor combina-se reversivelmente com E
Km altera, vmx no! [S] alta contorna o problema!!

ou

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Inibio incompetitiva
Inibidores s se combinam com o complexo ES
[S] alto no resolve!
Km e vmx diminuem!

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Inibio no competitiva
Inibidor se combina com enzima OU complexo ES
vmx cai e Km no altera
[S] alta no contorna o problema!

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Inibio
Determinao dos parmetros cinticos...
Realizar medidas SEM inibidores
Determinar Km e vmx
Realizar medidas com inibidor
Determinar Kmi e/ou vmxi

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Inibio pelo substrato

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Outros parmetros
Temperatura
Mudana de interaes

desnaturao

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Outros parmetros
Temperatura
Fenmenos antagnicos
Aumento taxa de reao x desnaturao

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Desnaturao
Cintica

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Desnaturao
Cintica
Tempo de meia vida necessrio para queda de 50% de
atividade

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Outros parmetros
pH
Ionizao

Mudanas conformacionais

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Outros parmetros
Fora inica
Presso
Tampo
Fora inica
pH
Natureza dos ons

Pureza dos reagentes


inibidores

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Imobilizao de enzimas
Vantagens
Recuperao e reaproveitamento do
biocatalisador - $$$$
Maior produtividade
Mais quantidade de catalisador por volume de
reator
Facilidade operacional
Possibilidade de aumento da estabilidade

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Reatores

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Reatores

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Metodologias

Adsoro

Ligao covalente

Ocluso

Confinamento em

membranas

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Metodologias

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Ocluso
Matriz de gel

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Ocluso
Matriz de gel
Vantagens
Menor resistncia transferncia de massa
Problemas
Perda da enzima pelos poros
Difcil acesso de substratos macromoleculares
Perda de atividade durante a imobilizao

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Perda de atividade

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Adsoro
Suportes
Neutros x carregados
Albumina, bentonita, slica gel, resinas
polimricas diversas
Resinas inicas ligaes inicas com
grupamentos funcionais
Celulose, Sephadex, etc

Problemas
Dessoro da enzimas
Necessidade de ligaes cruzadas
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