Clonality Analysis and Tumor of Unknown Primary:

Applications in Modern Oncology and Surgical

Pathology
5.1 Klon Genişlemesi Neoplazinin Hallmarkı mıdır?
5.1.1 Genel Bakış

• Klonalite, bir grup hücrenin tek bir ortak atadan, kök hücre'den genetik veya
epigenetik olarak özdeş olduğu ilkesine atıfta bulunmaktadır
• Klonal çoğalma, tüm insan neoplazilerinin temel bir özelliğidir
- Tümörler kök hücre veya progenitör hücrede oluşan bir dizi genetik / epigenetik
değişikliğin sonucu olarak ortaya çıkmaktadır
- Bir kanser kök hücresi, kök hücreye başlangıçta bir büyüme avantajı sağlayan aynı
genetik / epigenetik değişiklikleri gösteren daughter hücreler oluşmasına neden olur
- Sonrasında daughter hücrelerindeki diğer genetik değişiklikler ek büyüme
avantajları sağlar
• İnsan genomun ile ilgili son ilerleme, kanser terapisi ve tanı yaklaşımını yeniden
şekillendirmekte
- Moleküler belirteçler, en erken, en çok tedaviye cevap veren evrelerde tümörleri
saptamaya yardımcı olur
- Hastalara genetik profillemeye uygun olarak yaklaşılabilir
- Yeni yaklaşımlar, kanser biyolojisini derinleştirir ve bilgiyi daha etkili ve daha az toksik
tedavilere çevirir.
• Klonalite analizi için en önemli ilke 1970'lerin sonunda önerildi ve bunun temelinde
kadın hastalarda farklı X kromozomal inaktivasyon kalıplarının ve çeşitli somatik
mutasyonların keşfi yatmaktadır.
• Klonalite ilkesi zamanla gelişmektedir ve bu nedenlede klonalite analizinin yöntemleri
ortaya çıkmıştır
- Geleneksel kanser modelleri tüm tümör hücrelerinin yeni tümörler oluşturabileceğini
ve eşit derecede tümöre katkı da bulunduğunu gösterdiğini ileri sürer
• Tümör, genel hücrelerdeki proliferasyonun düzenleyici mekanizmalarındaki
bozulmadan kaynaklanır
- Herhangi bir hücre tipi Karsinogenesis'in hedefi olabilir
- Tümör bir klonal proliferasyondur
- Modern kanser modelleri, yalnızca tümör kök hücrelerinin yeni tümörler
oluşturabileceğini önermektedir (Şekil 5.1)
• Tümörlerde düzensiz hücre büyümesi, kök hücre kendini yenileme düzenleyici
mekanizmasının bozulmasından kaynaklanır
• Dolayısıyla kanser, kök hücrelerdeki düzenleyici mekanizmalar bozuktur ve basitçe
olay çoğalma sinyallerinin artmasından kaynaklanmamaktadır
• Sadece kendi kendini yenileme kapasitesine sahip kök hücreler veya öncü hücreler
karsinogenezin hedefidirler (ayrıca bkz. Bölüm 3)
• Genetik değişimler bu yüzden aktarılabilir ve aynı kök hücreden türeyen tüm kanser
hücresi popülasyonları tarafından paylaşılır
• Uzun süren kanserojen etki, kanser kök hücrelerinin bir kısmına veya tamamına yeni
moleküler değişiklikler kazandırabilir ve alt klon oluşturabilir
5.1.2 Tümör oluşum modelleri
5.1.2.1 Monoklonal Tümör Modeli
• Genetik hasar veya epigenetik değişiklikler karsinogenezide kritik rol oynar
• Karsinojenez hem fenotipik hem de genetik seviyelerde çok basamaklı bir
süreçtir
• Pek çok tümörün tek bir kök hücre kurucusunun (kanser kök hücresi) klonal
genleşmesinden kaynaklandığı bildirilmiştir; dolayısıyla tümör, klonal bir tümör
hücresi popülasyonundan oluşur
• Monoklonal kanser teorisi, tümör oluşumunda bilinen birçok moleküler
olayla uyumlu olduğu için caziptir
• Kanser kök hücrelerinde oluşan somatik mutasyonlar ve / veya epigenetik
değişiklikler birikerek kanser kök hücresinden daughter hücrelere aktarılabilir ve
böylece aynı genotip ve fenotipe sahip bir tümör klonu oluşabilir.

• Kanser kök hücresinde oluşan mutasyonlar istikrarlı bir şekilde nesline geçtiğinden,
bu mutasyonların varlığı klonal belirteçler olarak kullanılabilir

• Klonal tümör hücreleri, uyumlu bir somatik mutasyon ve / veya epigenetik

değişiklik paterni sergilemektedir

• Bir kanser kök hücresindeki ve onun soyunda bir tümör baskılayıcı genin/
onkogeninin aktivasyonu ve silinmesi / inaktivasyonu, karsinogenezideki yaygın
durumlardandır (Şekil 5.2)
• Antiapoptosis genlerinin aktivasyonu ve apoptoz genlerinin
inaktivasyonu / kaybı da klonal kanserler tarafından paylaşılan özelliklerdir
- Antiapoptosis genlerinin aynı anda yukarı doğru düzenlenmesi ve
apoptoz genlerinin aşağı düzenlenmesi, seçici bir kinetik avantaja ve
dominant bir klonun genişlemesine neden olur
• Epigenetik bozukluklar, karsinogenez sırasında ilgili genlerin ekspresyon
seviyelerini değiştirir
- Epigenetik durum genellikle klonal hücre popülasyonu arasında tutarlıdır
ve bu nedenle klonalite analizinde kullanılabilir
- En önemli epigenetik etkinin DNA metilasyonu aracılığıyla gerçekleştiği
düşünülmektedir.
Çok adımlı (multistep) karsinogenez

• Çok aşamalı karsinogenez duyarlı kök hücrelerin genomunda kademeli olarak

gen / epigenetik sapmaların biriktirilmesidir
• 1997'de Kinzler ve Vogelstein, karsinojenetik genler açısından, gatekeeper ve
caretakers kavramlarını önerdiler (Şekil 5.3)
- Gatekeeper hücrelerin büyümesini inhibe ederek veya hücre ölümünü teşvik ederek
tümörlerin büyümesini doğrudan regüle eden bir gen sınıfıdır. Bilinen gatekeeper arasında
APC, TP53, b-katenin, Rb, NF1, VHL ve diğerleri bulunur

• Tümörojenez, dokuya özgü gatekeeper yolağının bozulmasıyla başlatılır

• Spesifik bir hücre tipinde gatekeeper dışı kalması belirli bir kansere yol açar
• Bir gatekeeper genin tek bir mutant alleline sahip duyarlı bireyde, hastalık oluşması için ek bir
mutasyona ihtiyacı vardır; böylelikle allel kanseri başlatmak üzere inaktif hale gelir
- Caretakers, genomun bütünlüğünü koruyan genlerdir
• İnaktif caretakers doğrudan tümörleri teşvik etmez, ancak hücrede
gatekeeperde dahil olmak üzere tüm genleri etkileyen yüksek bir mutasyon
oranına yolaçar
• Caretakers, nükleotid eksizyon tamir genleri, mismatch tamir genleri, ATM
genleri, BRCA1 ve BRCA2 genlerini içerir
• Bir kanseri başlatmak için üç ardışık somatik mutasyona ihtiyaç duyulmaktadır:
kalan caretaker allel mutasyonu ve her iki gatekeeper allel mutasyonu

• Kanser insidansı yaşla birlikte artmakta ve çok adımlı karsinogenez teorisini

desteklemektedir
• Çok adımlı karsinogenezis, sıralı bir somatik mutasyon birikiminin kök
hücreleri bir kanser kök hücresine ve sonrasında da klonal olarak kansere
dönüştürdüğü progressif bir olaydır

- Mutasyonların birikimiyle birlikte, etkilenen hücreler normal

histolojiden hiperplastik / displastik lezyonlara ve nihayetinde kansere
morfolojik bir geçiş yaşarlar

• Genetik değişiklikler aktarılabilir ve bu nedenlede aynı kök hücre kaynaklı

türetilmiş kanser hücrelerinin tümü tarafından paylaşılır
Poliklonal Tümör Modeli Alan Kanserizasyon Teorisi

• Alan kanseri oluşumu kavramı, ilk kez Slaughter ve arkadaşları tarafından 1953'te ortaya
atıldı.
-, ağız mukozasındaki kanserlerin çok merkezli olası ve yüksek kanser nüks olasılığı Slaughter’e
buralarda genetik olarak değişime kanser hücrelerinden mikroskopik olarak görünmez bir
"alan" olduğunu düşündürdü

• Teori, ayrıca, etkilenen "alan" ın kanserojenezise duyarlılığının arttığını ve bunun da

hücrelerin kanserlere meyilli olmalarını ileri sürmektedir.

- Çevre maruziyetleri veya kanserojenler, organ yüzeyinin daha geniş bir alanı içerisindeki kök
hücreleri etkiler ve hücrelerin birden fazla bölgede hasara uğramasına neden olur

- Alan kanserleşmesi, maruz kalan yüzeyin tamamında klonal hücre yamalarının premalign
transformasyona uğradığını ileri sürmektedir.
- Alanda şekilenen premalign lezyonların çok sayıda hücresel yaması, anatomik
bir konumda birden fazla lokal ikinci primer tümörün eş zamanlı veya
metakronik olarak oluşmasına yolaçar

- Sonuçta, polifere olan alanda etkilenen kök hücrelerin her biri çoğalar
genilyecek, aşamalı olarak normal epitelin yerini alacak ve klonal kansere
dönüşecektir

- Aynı tümörde (veya aynı hastadaki ayrı tümörlerde) farklı X kromozomal

inaktivasyon paternleri ve uyuşmayan genomik mutasyon paternleri, hipotez için
destekleyici kanıtlar sağlamaktadır.
• Teori, multipl primer tümörlerin ve lokal olarak tekrarlayan tümörlerin gelişimini
açıklar
- Alan kanseri, kanserojen olaylara bağlı olarak, genetik olarak farklı klonlardan
çoklu odak alanları oluşmasını açıklar (Tablo 5.1)

- Her kanser klonu farklı bir kanser kök hücresinden kaynaklanır ve farklı genetik
değişiklikler taşır.

- Kanser klonu, alanda eşzamanlı veya metakron şeklinde tümörler oluşturabilir

• Oral kavite, akciğer, özofagus, göğüs, deri, idrar kesesi, vulva ve kolon gibi birçok
organ sistemi incelenmiştir.

- Moleküler bulguların hücrelerin birçok alanda yama şekilde genetik değişiklikler

sergiliyerek çoğaldığını göstermesi bu alan kanserleşme modelini
desteklemektedir.

- Dış kanserojenler, farklı bölgelerde bağımsız genetik değişikliklere neden olup,

birden fazla genetik olarak ilişkisiz tümörün gelişimine neden olur
• Önemli olan, kanserojen maddelerin alandaki birtakım etkilerinin primer kanser
çıkarıldıktan sonra da süremesi ve bunun yeni kanserlere neden olmasıdır.

• Alan kanseri oluşumu, tek hücre hattında somatik değişikliklerin birikimi nedeniyle
neoplastik değişikliklerin belirli bir süre içinde geliştiği çok adımlı bir süreci
varsaymaktadır

- Alan kanserleşmesini destekleyen önemli kanıtlardan biri, genetik değişikliklerin

genellikle aynı sahadaki tümörü çevreleyen morfolojik olarak normal hücrelerde
de bulunmasıdır

- Tümöre bitişik olan bu morfolojik olarak normal hücreler, fenotipik normalden

displastik epitele dönüşümde bir ara basamakı oluşturur.
• Birden fazla tümörün ayrı olarak ortaya çıkması, genel karsinogenez kavramını
ortaya çıkarır; bunun aracılığıyla, daha geniş bir alan veya bütün organ
kanserojenlerce etkilendiğ belirtilmektedir

• Karsinogenetik süreç boyunca birden fazla tümör klonu mevcut olabilse de klonalite
analizlerinde psödomonoklonal görünümde ek bir büyüme avantajı nedeniyle bir klon
baskın hale gelebilir

• Genetik değişiklikler, kanser gelişiminin histolojik kanıtından çok önce bulunabilir ve

değişiklikleri taşıyan hücreler, kendileri kanser öncülü olabilir veya olmayabilirler
Kanserde Klonal Evrim

• Klonal evrim teorisi genetik dinamiği zaman çerçevesi içerisinde tanıtmaktadır

• Kanserojenez bir veya birkaç transforme kök hücreyi kapsamaktadır

• Karsinojenez, klonal genişleme, genetik çeşitlilik ve klonal seçimi içeren bir

süreçtir

- Ardışık alt-klonlar, kurucu hücrelerinden miras alınan genetik zemin ile ilave
genetik-epigenetik değişiklikler elde ettikten sonra oluşur.
- Ortamdan gelen seçici baskılar bazı alt klonların genişlemesine izin verirken diğerleri
tüketilir veya uykuda kalır

• Bir kanser klonal olarak heterojendir ve bir kanserdeki hücrelerin genetik yapısı, kurucu
hücre veya altklonal muadilleriyle tamamen aynı olmayabilir

• Kanserde fenotip, fonksiyon ve tedaviye yanıtta farklılıklara kanser hücreleri arasında

genetik heterojeniteneden olmaktadır.

• Kanserler zamanla gelişirler ve farklı histolojik ve anatomik bölmede yer alan farklı alt
klonlar şeklinde ortaya çıkarlar.
Histolojik olarak Farklı Koloklize Tümörler

• Histolojik olarak farklı kolo- lokalize tümörlerin kesin histogenezi tartışma konusu
olmaya devam etmektedir

• Bu morfolojik olarak çeşitlilik gösteren iki fazlı tümörlerin kökenini açıklamak için
klonaliteye dayalı iki karşıt teori önerilmiştir

- Bazı araştırmacılar, eşzamanlı olarak meydana gelen iki bağımsız, monoklonal

neoplazmın bir çarpışma tümörünü temsil ettiğine inanıyor

• Diğerleri, bu tümörlerin farklı diferansiyasyon ile histolojik açıdan farklı tümörlere

dönüşen ortak bir klonal kökenden oluştuklarına inanıyorlar.
Rastgele Çarpışma Teorisi

• Çarpışma teorisi esas olarak morfolojik analizlere dayanmaktadır. Bu tür tümörler

sıklıkla farklı bileşenler arasında kademeli geçiş olmadan ani geçiş gösterirler

• Colosion tümörler çeşitli organlarda bildirilmiştir ve organlarda iki bitişik ancak

histolojik olarak farklı tümörlerin (histolojik olarak karışmayan) birlikteliğini temsil
eder

• Rastgele çarpışma teorisi, birbirine çok yakın bir zamanda başlatılan iki farklı
tümör türünün, klinik olarak tek bir tümör olarak tanınabilen bir poliklonal
neoplazm ile sonuçlanabileceğini önermektedir

• Colosion tümörleri mide, akciğer, yemek borusu, yumurtalık ve bağırsakta

bildirilmiştir

• Bu tür tümörler poliklonal olup her bileşende farklı genetik değişiklikler gösterir
Farklı Farklılaşma Teorisi

• Farklı diferansiyasyon teorisi, farklı histolojiye sahip kolokalize tümörlerin

ortak bir klonal köken aldığını, örneğin sarkomatoid karsinomun

- Bu hipotez için destekleyici kanıtlar, her iki bileşen de uyumlu genetik

değişiklikler bulundurmaktadır

- Bir tümör tipi, genetik değişiklikler, genetik istikrarsızlık ve birden çok alt-
klon üretimi ile çok adımlı karsinogenez yoluyla ilerleyebilir

• Tümör kök hücreleri, klonal genişleme ve fenotipik farklılaşma için genetik

ve mikro çevre değişikliklerine bağımlıdır

- Bir tümör tipi, bir fenotipten, iç ya da dış ortam tarafından indüklenen

moleküler programlara sekonder diğerine transdifferentiasyon gösterebilir
Yama fenomeni

• Patch fenomeni, Schmidt ve Mead tarafından 1990'larda X kromozom inaktivasyon

analizi kullanılarak tanıtılan bir kavramdır

- Bir yama genel olarak ortak bir kök hücreden türetilen, ortak genetik özellikleri
paylaşan ve kadın bireylerde aynı X kromozomunun inaktive edilmesine neden olan
bir hücre grubu olarak kabul edilir (Şekil 5.4)

- Yama boyutu değişir. Mesane ve midede yama boyutu 1 cm2'ye, kıl folikülünde ise
0.2-1.0 cm2'dir. Diğer dokularda, yama boyutu yaklaşık 0.2-0.3 cm2'dir

- Bazı yamalar bir bağırsak kriptosu veya göğüs kanalı lobüler birimi gibi anatomik
sınırlara karşılık gelir; Bununla birlikte, bazıları karaciğerdeki yamalar gibi anatomik
sınırları takip etmez

- Potansiyel olarak büyük yama boyutlarından dolayı, X kromozomu inaktivasyon

analizi için izole edilen hücreler tek bir yamadan gelebilir.
Çok geniş alanların örneklenebileceği multiple alan hücre izolasyon tekniği, bu
klonalite analizlerinde daha doğru sonuçlar elde etmede yardımcı olabilir

• Göğüs terminali lobuloduktular ünitesi genellikle bir yamanın tamamen

içindedir; Bu nedenle meme tümörlerinin poliklonal kökenleri, normal bir
normal kontrol kullanılmadıkça göstermek zor olabilir

• Kolon epitelindeki büyük yama boyutları nedeniyle, X kromozom inaktivasyon

çalışmaları, monoklonal sonuçlara doğru aşırı derecede önyargılıdır
• Alan karsinogenezisindeki yama fenomeni

- Alan karsinogenezide alandaki birçok kök hücre, santral değişiklikler kazanır ve

genetik olarak değiştirilmiş hücre kümelerini yamaları oluşturmak için böler

- Yamadaki bu değiştirilmiş hücreler morfolojik olarak tanınabilir veya

tanınmayabilir, ancak hepsi aynı genomik değişikliklere sahiptir

• Bu yamalar, TP53 mutasyonları gibi genetik mutasyonlara veya rastgele olmayan X

kromozomu inaktivasyonu gibi anormal epigenetik süreçlere dayanarak tanınabilir

• Bir yamadaki hücreler, kanserojenlere yatkın hale gelebilir ve somatik mutasyonlar

biriktikçe malign transformasyona daha duyarlı hale gelebilir
- Aynı genetik değişiklik desenini gösteren bir veya birkaç kök hücrenin
soyundan tek bir yama oluşturulabilir

- • Bu yamalardaki hücreler monofenotipiktir ancak monoklonal olabilir veya

olmayabilir
X Kromozom Bağlantılı Klonalite Analizi

X Kromozomu İnaktivasyonunun İlke ve Anlamı

• X kromozom inaktivasyonu (lyonizasyon olarak da adlandırılır), Mary Lyon tarafından

1961'de önerilen bir süreçtir.

 Bu, kadın memelilerde bulunan X kromozomunun iki kopyasından birinin rasgele ve

kalıcı olarak inaktive edildiği kromozom genişlemesi epigenetik gen susturma
sürecidir (için dozaj tazminatının amacı)

• Aktif olmayan X kromozomu metillenir ve bunu takiben histon deasetilasyonu yapılır ve

kromatin baskıcı heterokromatin ile sıkıştırılarak bir Barr cismi oluşturulur (seks kromatin
olarak da adlandırılır).
• X kromozomu inaktivasyonu erken embriyogenezde (blastosist evresi)
meydana gelir ve kalıcıdır (Şekil 5.5).

 Bu süreçte rasgele ya anne ya da babadan türetilen X kromozomu inaktive

edilir

• Bir kez kurulduktan sonra aynı inaktive X kromozomu istikrarlı bir şekilde
muhafaza edilir ve tüm sonraki hücre bölünmeleri yoluyla yavru hücrelere
geçirilir
X kromozomlarının diferansiyel metilasyonunun (inaktivasyonu) analizi, kadınlarda
klonalite analizinin temelini oluşturmaktadır

• Ortak bir progenitörden türetilen hücreler, aynı inaktive X kromozomunu paylaşır

• X kromozomu inaktivasyonu, normalde rastgele bir süreçtir ve kadınlarda yaklaşık

olarak eşit sayıda maternal ve paternal derivasyonlu X kromozomları etkisiz hale
getirilir

• Sonuç olarak, normal dokularda rastgele X kromozomu inaktivasyon paternlerine

sahip hücresel mozaikler oluşur.

 Aksine, tümörlerde meydana gelen klonal hücre genişlemesi, tüm hücrelerde

rasgele olmayan bir X kromozom inaktivasyonu modeli oluşmasını sağlamaktadır.

 Tek bir progenitör hücreden kaynaklanan tümör aynı inaktif X kromozom paternine
sahiptir sahiptir (Şekil 5.6)
X Kromozom İnaktivasyon Kontrol Mekanizmaları

• X inaktivasyon merkezi (XIC), X kromozomu üzerinde Xq12-13'te bulunur ve X

kromozomu inaktivasyonuna neden olmak için gerekli ve yeterlidir

- XIC XIST, TSIX JPX ve FTx da dahil olmak üzere, dört X kromozomu inaktivasyonuna
katılan non-translate RNA geni bulunmaktadır

- XIC ayrıca bilinen ve bilinmeyen düzenleyici proteinler için bağlama alanları içerir

• X kromozomu-inaktive edici spesifik transkript geni (XIST), transkribe edildiği X

kromozomunun spesifik susturulmasına aracılık eden geniş bir nontranslate RNA'yı
kodlar

- Aktif olmayan X kromozomu (Xi) aşamalı olarak XIST RNA ile kaplanır, ancak aktif X
kromozomunda (Xa) bu gerçekleşmez

• Xi boyunca genlerin susturulması, XIST RNA ile kaplandıktan hemen sonra meydana
gelir

- XIST geninden yoksun X kromozomları inaktive edilemez

• XIST antisens RNA geni (TSIX), XIST'e antisense olan büyük bir RNA'yı kodlar

- TSIX, XIST'in negatif düzenleyicisidir

- TSİX geni, XIST'in DNA'sının zıt dizesinden transkripte edilir; Dolayısıyla,

transkriptler XIST'e karşı antisens özellipği gösterir

- TSIX ekspresyonu bulunmayan X kromozomu inaktive edilir. XIST genini başka

bir kromozomda anormal olarak ifade etmek, o kromozomun susturulmasına
neden olur

- İşlem, kodlamayan XIST RNA'sının transkripsiyon ve cis lokalizasyonu ile

başlatılır ve daha sonra heterokromatin yapının oluşturulması ve inaktive X
kromozomu üzerindeki genlerin susturulması ile ilgili epigenetik makineler
olaya katılır (örneğin, histon modifikasyonları ve DNA metilasyonu)

• İnaktif X kromozomu, yüksek oranda DNA metilasyonu, düşük seviyelerde

asetillenmiş histon H4, düşük histon h3 lisin-4 metilasyon seviyeleri ve yüksek
histon H3 lisin-9 metilasyon seviyelerine sahiptir
Human Androgen ReceptorGene X ChromosomeInactivation Analysis

• The human androgen receptor gene(HUMARA) X chromosome inactivation

analysisis based on methylation-sensitive restrictionenzyme that can only cut
nonmethylatedrestriction site (Fig. 5.7)
– The HUMARA is located at Xq11.2–12
– A highly variable region of CAG trinucleotiderepeats is located within the first
exonof the gene
İnsan Androjen Reseptör Geni

X Kromozom Aktivasyon Analizi

• İnsan androjen reseptör geni (HUMARA) için X kromozom inaktivasyon analizi
metillenmemiş restriksiyon alanını kesebilen metilasyona duyarlı restriksiyon
enzimine dayanır (Şekil 5.7)

- HUMARA, Xq11.2-12'de
- CAG trinükleotit tekrarlarının oldukça değişken bir bölgesi, genin ilk eksonu
içinde bulunur
- Bu tekrarlar, diferansiyel metilasyona yatkın ve metilasyona duyarlı restriksiyon
enzimleri (HhaI veya HpaII) için kesim yerleri içeren HUMARA geninin 5’ promotör
bölgesine yakın bir yerde bulunur

- Araştırmalar, bu polimorfik tekrarların yakınındaki HpaII ve HhaI bölgelerinin

metilasyonunun, X kromozomu inaktivasyonuyla korele olduğunu göstermiştir
- Alternatif olarak metile sitozinler sodyum bisülfitle modifiye edilebilir ve sitozin,
urasille değiştirilirken, metillenmiş sitozinler etkilenmemektedir

- Metilasyona spesifik primerler kullanılarak PCR (polimeraz zincir reaksiyonu),

metillenmiş DNA metile olmayan DNA dan ayrıştırılabilir.
• Kısa prosedürler

- Genomik DNA, mikrodiseksiyonla normal ve tümör dokularından ekstrakte edilir

- Genomik DNA metilasyona duyarlı restriksiyon enzimler olan Hyal veya HpaII
kullanılarak sindirilir

- Metillenmiş (inaktive edilmiş) X kromozomu, metilasyona duyarlı enzim HhaI veya

HpaII ile sindirilemez ve böylece amplifiye edilebilir.

- Metilasyonsuz (aktif) X kromozomu kesildiği için amplifiye edilemez

- PCR ürünleri DNA fragmanlarını görselleştirmek için elektroforez işlemine tabi

tutulur
• X kromozom inaktivasyon analiz sonuçlarının yorumlanması

- Bir hücre popülasyonunun klonalite analizi, yalnızca aynı embriyolojik orijinli

çevreleyen normal dokunun klonalliği ile ilişkili olarak doğru yorumlanabilir

- Bilgi verici bir durum: PCR amplifikasyonundan sonra normal DNA'da iki allelik
bant mevcuttu

- Bilgilendirici olmayan durum: PCR amplifikasyonundan sonra normal DNA'da

sadece bir allelik bant mevcuttu
– In informative cases, the PCR productsfrom digested normal control tissue
showa double band on electrophoresis (randomX chromosome inactivation),
whiledigested clonal tumor DNA shows onlyone band (nonrandom X
chromosomeinactivation)
– A nonrandom X chromosome inactivationpattern indicates clonal
proliferation;a random X chromosome inactivation patternindicates a polyclonal
process (mosaiccell populations)
– Identical X inactivation patterns in two distincttumors (with either upper or
lower bands diminished) suggests a possiblecommon monoclonal origin (Fig.
5.8)
– Opposite X inactivation patterns, such asloss of upper band in one tumor and
loss oflower band in another tumor, support anindependent origin for each
tumor
- Bilgilendirici vakalarda, sindirilmiş normal kontrol dokusundaki PCR ürünleri
elektroforezde (rasgele X kromozomu inaktivasyonu) çift bant gösterirken, kesilmiş
klonal tümör DNA'sı sadece bir bant gösterir (rasgele olmayan X kromozomu
inaktivasyonu)

- Rasgele olmayan bir X kromozom inaktivasyon paterni klonal çoğalmayı gösterir;

rasgele bir X kromozom inaktivasyon paterni bir poliklonal süreci gösterir (mozaik
hücre popülasyonları)

- İki farklı tümörde (üst veya alt bantlar azalmış) aynı X inaktivasyon paternleri olası bir
yaygın monoklonal kökenli olduğunu düşündürür (Şekil 5.8)

- Tek bir tümörde üst band kaybı ve başka bir tümörde alt band kaybı gibi karşıt X
inaktivasyon paternleri, her tümör için bağımsız bir orijini desteklemektedir
HUMARA X kromozom inaktivasyon Klonalite Analizinin Avantaj ve Kısıtlamaları

• Avantajlar
- X kromozom inaktivasyonu, kadınlarda klonal çoğalmanın en tutarlı bilgilendirici
göstergesidir

- Kadınların % 90'ı heterozigot ve X kromozom inaktivasyon analizi için uygundur

- Farklı olarak metilleştirilmiş restriksiyon alanlarının gen lokusuna yakınlığı, bu

tekniklerin fragmente DNA üzerinde kullanılmasını sağlar (PCR ürünlerinin boyutu
yaklaşık 200-280 bp'dir)

- Yöntem basit ve sonuçlar

• Sınırlamalar

- X kromozomu inaktivasyonu yalnızca kadınlar için geçerlidir

- Kalıtılmış veya edinilmiş dengesiz metilasyon (rastgele olmayan X-

kromozom inaktivasyonu paterni) ve malignitelerde anormal DNA
metilasyon paternleri, sonuçların yorumlanmasını zorlaştırabilir

- X kromozomundaki tüm genler için katı dozaj kompensasyonu gerekli

olmayabilir

• X bağlantılı genlerin % 15'i inaktivasyondan kaçar ve X bağlantılı genlerin

% 10'u, inaktivasyonun değişken kalıplarını gösterir
- X'e bağlı klonality analizi sadece rasgele ve rasgele olmayan X kromozom
inaktivasyonunu ayırt eder

- Tüm klonal proliferasyonlar neoplastik değildir.

- Klonal süreçler neoplastik süreçlere eşdeğer değildir

Teknik Hususlar
Skewed DNA metilasyonu
• X kromozomu inaktivasyonu genellikle rasgele olup, maternal veya paternal kaynaklı
aktif X kromozomlarına sahip hücrelerin eşit karışımlarına sahip dokular üretir

• Bununla birlikte, skewed X inaktivasyon paternleri oluşabilir ve bu çarpıklık kalıtsal

veya kazanılmış ve embriyonal yaşamın erken evresindeki karmaşık mekanizmalardan
kaynaklanabilir (Tablo 5.2)

• Skewed metilasyon, inaktive maternal veya paternal X kromozomlarının asimetrik

dağılımıdır (Şekil 5.9)

• 3: 1 oranında inaktive Xp: Xm ile X kromozom inaktivasyonu veya bunun tersi,

skewed X kromozom inaktivasyonu olarak kabul edilir
• Primer çarpık metilasyon kalıpları, embriyogenez sırasında tesadüfi X kromozomu
aktivasyonu sırasında varolan sınırlı sayıda kök hücre içindedir

- Kök hücrelerin asimetrik bölünmesi, bazı kök hücrelerinin terminal diferensiyasyon

yoluyla kaybedilmesine neden olarak eğik metilasyona neden olabilir

- Azaltılmış preküsör havuz boyutu, çarpık X kromozomu inaktivasyonuna katkıda

bulunur

- Monozigotik ikizler, eşleştirme süreciyle ilişkili olabilecek aşırı skewed oranına

sahiptir. Eşleştirme işlemi, embriyoya katkıda bulunan hücrelerin sayısını azaltır

• Skewed metilasyon kalıpları, kalıtsal faktörlerden etkilenebilir ve genetik olarak

bulaşabilir

- Bir ebeveyn X kromozomunun tercihli olarak etkinleştirilmesi ile oldukça çarpık

metilasyon örüntülerinin ailevi konsantrasyonları bildirilmiştir
• XIST geninin mutasyona uğraması veya anormal baskısı çarpık inaktivasyona
neden olabilir

• XIC'nin disregülasyonu veya Xq28'in (psödoautozomal bölge) fiziksel olarak

delesyonu X kromozomu inaktivasyonunun çarpılmasına neden olabilir

• XIST mutasyonları doğrudan X kromozom inaktivasyonunun çarpılması ile

doğrudan ilintilidir.

• Birçok X bağlantılı bozukluğun X kromozomu inaktivasyonunda çarpıklığa

neden olduğu bilinmektedir (Tablo 5.2)

• Edinilmiş X kromozom inaktivasyonunun çarpıklığı ayrıca seçilim ve yaşlanma

prosesi ile ilgili olabilir

- Yaşın inaktivasyon üzerinde doğrudan bir etkisi olduğu gösterilmiştir. Aşırı

dengesiz X inaktivasyon paternleri yaşlı kadınlarda görülür. Yaşlanma süreci
boyunca kök hücrelerinin tükenmesi söz konusudur

- Yaşlanma sürecinde bir somatik seçilim oluşur. Küçük bir büyüme avantajı,
belirli hücre popülasyonlarını veya klonlarını öncelikli olarak etkileyebilir. Bu tür
seçim farklı dokularda değişkenlik göstermektedir
• 5-10 yaşındaki monozigot ve dizigotik kız ikiz üzerinde yapılan çalışmada çarpık XCI'nin
erken çocukluk döneminde kurulmuş olabileceğini gösterdi.

- Kuruluştan sonra XCI'de kazınmış çarpıklık öncelikle stokastik mekanizmalar aracılı

• Aynı kişide farklı dokulardaki X kromozom inaktivasyon paternleri, doku spesifik

inaktivasyon paterni olarak adlandırılan bir fenomen olarak karşımıza çıkar
- Çarpık metilasyon gastrointestinal mukoza ve tiroidde düşük olmakla birlikte kan
hücrelerinde anlamlı derecede yüksektir

- Hematopoietik hücreler, özellikle kısa yaşam ömürleri ve yüksek üretim hızları

nedeniyle seçim sürecine tabidir. Ölçümün tanımı ve niceliksel doğruluğuna bağlı
olarak, bu hücrelerin % 20'sine X kromozom inaktivasyonunda çarpıklıklar olabilir

- Bir klonal hücre popülasyonunun X kromozom inaktivasyon analizi ile gösterilebilmesi

için, bir doku örneğinde gözlemlenen X kromozom inaktivasyonunun paterni, aynı soytaki
normal dokuda görülen X kromozom inaktivasyonuna referansla yorumlanmalıdır. Bir
hematolojik malignite incelenirse, kan hücrelerinde çarpık metilasyon insidansının yüksek
olması nedeniyle alternatif bir klonalite analizi yöntemi düşünülmelidir.