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Bibliotecas genômicas e de cDNA

Prof. Dr. Maximiliano Zierer


Biblioteca de genes X Biblioteca de cDNA
• Uma biblioteca de genes é uma coleção de fragmentos de
DNA de uma determinada espécie de organismo, obtidos a
partir da ação de endonucleases de restrição, ligados
aos vetores apropriados e clonados após terem sido
inseridos num hospedeiro.

Uma biblioteca de genes pode


ser uma colônia de bactérias
(se for construída utilizando
um plasmídeo ou um
cosmídeo) ou placas
de fagos (se o vetor utilizado
for um fago) com DNA
recombinante.
• Considera-se que essa biblioteca seja representativa de todos
os genes do organismo, sendo muito útil quando se pretende
isolar um gene específico.

• Assim, torna-se claro que quando se quer clonar um


determinado gene ou o cDNA (DNA complementar) das
mensagens por ele codificadas (mRNA) é necessário a
construção de coleções de genes recombinantes.

• Se estes genes recombinantes forem obtidos a partir do DNA


genômico, sendo portadores de moléculas representantes de
todo o genoma, constituem uma biblioteca genômica.

• Uma biblioteca de cDNA é uma coleção de clones de DNA


complementar derivados de toda a população de RNA
mensageiros da célula ou tecido de interesse.
Preparação do DNA a ser inserido
1. Digestão do DNA usando enzimas de restrição;
2. Fracionamento por Centrifugação em Gradiente de
Sacarose: a solução de DNA digerida é aquecida para que
ocorra a dissociação de possíveis fragmentos agregados.
Depois é aplicada sobre um gradiente de sacarose de alta
salinidade. Este gradiente é aspirado, de baixo para cima,
com ajuda de uma bomba peristáltica. A porção mais densa
do gradiente que contem o DNA de maior massa molecular,
é aspirada primeiro. Após a centrifugação, as frações desse
gradiente são coletadas para análise (3)
3. Eletroforese em Gel de Agarose: as frações contendo os
fragmentos de DNA de tamanho apropriado são utilizadas
para a ligação com o vetor.
Centrifugação em Gradiente de
Sacarose
• A complexidade dos organismos superiores (o genoma de um
mamífero é constituído por 3x109 pares de bases (pb)
aproximadamente, o que faz com que se um determinado
fragmento tiver 3000 pb, será apenas uma parte em 106 de uma
preparação do DNA total) e a existência de uma espécie de
mRNA rara (que pode compreender apenas uma parte em 105 ou
106 da fração de RNA mensageiros de uma célula), obriga à
obtenção de elevadas quantidades de genes.

• Deste modo, é garantida a presença na biblioteca de pelo menos


uma versão de todas as seqüências da população alvo. Para
conseguir satisfazer esta condição, de modo a tornar a biblioteca
útil, segue-se um procedimento que é semelhante nos dois tipos
de bibliotecas e que engloba estratégias específicas na
preparação do DNA alvo e na escolha do vetor de clonagem. O
DNA genômico ou os cDNAs previamente preparados são
inseridos no vetor escolhido, e após ser estabelecida a sua
ligação, são introduzidos no hospedeiro por infecção ou
por transformação direta.
Diferenças entre bibliotecas genômicas e de cDNA

• Na biblioteca genômica pretende-se que os genes estejam


representados na mesma proporção em que existem no
organismo.
• Na de cDNA (obtido por cópia do mRNA), apenas estão
presentes os genes que estão sendo expressos em determinado
momento, na proporção dessa expressão.
• Assim, há variações entre bibliotecas de cDNA obtidas de células
colocadas em condições ou estados de desenvolvimento
diferentes, ou obtidas de diferentes tecidos de um mesmo
organismo.
• Nas bibliotecas de eucariotos, uma diferença importante resulta
das diferenças da estrutura genética (DNA) e da estrutura dos
seus transcritos (mRNA).
Vantagens da Biblioteca de cDNA
• Não tem íntrons, o que facilita a identificação e a
caracterização dos genes, não havendo perigo de que partes
de um determinado gene sejam recuperadas por outros
genes.

• O cDNA apenas representa os genes que estão sendo


ativamente utilizados pela célula, pois a RNA polimerase
apenas transcreve em mRNA os genes ativados;

• A biblioteca de cDNA fica enriquecida para esse determinado


gene, porque, em vez de termos uma ou duas cópias, temos
tantas cópias quantos mRNAs a célula conseguir produzir
para esse gene;
Vantagens da Biblioteca de cDNA

• As bibliotecas de cDNA são mais fáceis de construir porque


o cDNA, tal como o seu mRNA molde, é relativamente
pequeno, portanto um cDNA inteiro pode ser inserido num
único vetor.

• Apesar disso, mantém-se a necessidade de construir uma


biblioteca uma vez que as células produzem dezenas de
milhares de mRNAs diferentes ao mesmo tempo, e portanto,
depois de usarmos a trancriptase reversa, continuamos com
uma grande quantidade de diferentes cDNAs.
Uso da Biblioteca de cDNA

• Uma biblioteca de cDNA é, muitas vezes, preferencialmente


utilizada para se iniciar a clonagem de um gene. Isto deve-se ao
fato de, sendo o cDNA (DNA complementar) derivado do mRNA
(RNA mensageiro), para uma determinada proteína expressa na
célula, obtêm-se bibliotecas em que a sua representação é
significativamente maior do que em bibliotecas genômicas, o que
auxilia o seu isolamento.

• A inexistência de íntrons facilita igualmente a determinação


direta da seqüência da mensagem codificada e dedução da
seqüência de aminoácidos da proteína por ela codificada, o que
se tem demonstrado extremamente útil na identificação de
inúmeras proteínas que ainda não o tinham sido genética ou
bioquimicamente estudadas.
• A ausência de íntrons também permite a direta transcrição e
tradução dos cDNA de células eucarióticas superiores em
bactérias e outros microorganismos, o que permite a produção
em massa de polipeptídeos importantes.
A síntese, clonagem e isolamento de cDNAs
específicos dá-se, resumidamente em 4 etapas:
1. Síntese in vitro de cDNAs de cadeia dupla partindo de
mRNAs isolados do tecido de interesse, utilizando a
enzima trancriptase reversa;

2. Preparação dos cDNAs para ligação com o vetor escolhido;

3. Introdução dos cDNAs recombinantes numa célula


hospedeira para serem replicados. Dar-se-á a amplificação
dos recombinantes e, consoante o vetor utilizado, a
expressão das proteínas codificadas pelas mensagens que
deram origem aos cDNAs;

4. Identificação de clones específicos.


Síntese de cDNAs de cadeia dupla
• A elaboração de uma biblioteca de cDNA inicia-se com o
isolamento do mRNA (substrato) total do tecido e com a seleção
de parte de RNA poliadenilado o qual possui grande parte das
mensagens contidas na célula.

• Este isolamento é efetuado por cromatografia de afinidade, em


colunas contendo oligo-dT. A escolha deste fragmento de RNA é
determinante para o processo restante, pois, se ele estiver
degradado, afetará a representatividade das seqüências na
biblioteca.

• Após este passo, efetua-se a síntese dos cDNAs através de


diversos processos, sendo o abaixo referido bastante comum: o
mRNA é utilizado como molde para a síntese da primeira cadeia
de cDNA, pela enzima transcriptase reversa.
• A transcriptase reversa tem a capacidade de catalisar in vitro a
polimerização de DNA a partir de RNA, necessitando de um
primer com a extremidade 3’OH livre, para poder começar a
síntese.

• Normalmente o primer utilizado é um pequeno oligonucleotídeo


de desoxitimidinas (poli-dT) que vai hibridar na cauda de poli-A
do mRNA.

• Resultam, desta reação, moléculas híbridas de DNA/RNA que


vão funcionar para a síntese da segunda cadeia de cDNA, como
um complexo de moléculas molde (cDNA) e primers (mRNA).

• Depois da síntese da cadeia de cDNA, a enzima RNase A vai


remover parcialmente o mRNA, pois esta vai cortando pedaços
do RNA da molécula híbrida RNA-DNA, formando nesta
espaços vazios (no mRNA).
• Os fragmentos não digeridos pela RNase A servem
como primers para que a DNA polimerase substitua
eficientemente o RNA por DNA, originando uma molécula de
DNA de cadeia dupla.

• Este DNA de cadeia dupla é tratado com T4 polimerase que


possui atividade 3’-5’, sendo utilizada para remover possíveis
nucleotídeos extras nas extremidades 3’ do cDNA.

• Obtemos assim uma molécula de DNA de cadeia dupla que é


a cópia exata de uma determinada mensagem.
Síntese de cDNA de cadeia dupla. O mRNA é extraído de um dado tecido e o cDNA é sintetizado a partir do
mRNA, por ação catalítica da transcriptase reversa: um oligonucleotídeo complementar à cauda poli-A da
extremidade 3' do mRNA hibridiza com este, servindo como primer da transcriptase reversa, que copia
então o RNA para uma cadeia complementar de DNA, formando um híbrido DNA/RNA. Tratando-o com
RNase H, esta faz-lhe cortes e cria espaços na cadeia de RNA. A cadeia complementar de DNA é então
copiada, formando-se cDNA de dupla cadeia por ação de uma DNA polimerase. O primer para esta reação
consiste no fragmento de mRNA original.
Vetores utilizados na construção
de uma biblioteca genômica
• Atualmente, os vetores mais utilizados na construção de
bibliotecas genômicas são fagos lâmbda (λ) e cosmídeos. Em
ambos os casos, fragmentos grandes de DNA obtidos por
fragmentação aleatória ligam-se ao DNA do vetor para poderem
ser empacotados em partículas de fago λ.

• As bibliotecas construídas com vetores λ são armazenadas e


propagadas na forma de fagos recombinantes. Estes vetores
possuem um fragmento central limitado por dois fragmentos
essenciais.

• O braço (fragmento) esquerdo, codifica as proteínas da cápsula,


e o braço (fragmento) direito, tem a origem de replicação
do fago e promotores de outros genes essenciais.
• Entre o fragmento central e os dois braços estão os sítios de
restrição usados na clonagem, orientados inversamente – SalI,
BamHI, EcoRI. A extremidade de cada braço apresenta um
segmento de cadeia simples (cos). Estes segmentos são
complementares entre si, permitindo assim a recircularização da
molécula e conseqüente replicação do fago dentro da célula
hospedeira.

• Este tipo de vetor é chamado vetor de substituição porque, no


processo de clonagem, a parte central do DNA do fago é
substituída pelo fragmento de DNA a ser clonado, originando
deste modo a molécula recombinante.
• Os fragmentos clonados são ligados aos braços do fago,
previamente preparados com BamHI, sendo esta mistura
empacotada in vitro em partículas virais.

• Para se selecionar apenas os fagos recombinantes, estes são


infectados numa bactéria lisogênica.

• A suspensão de fagos resultante pode ser armazenada durante


vários anos num frigorífico, com algumas gotas de clorofórmio
para prevenir o crescimento bacteriano, embora a concentração
do número de partículas infecciosas vá baixando gradualmente.

• A biblioteca também pode ser armazenada por congelamento


da mistura de ligação (fragmento de DNA/vetor).
• Na clonagem em cosmídeos, as partículas virais servem
apenas como veículos para introduzir o DNA recombinante
dentro da bactéria e uma vez dentro dela o
cosmídeo comporta-se como um plasmídio grande.

• Os cosmídeos podem aceitar inserções de cerca de 45 kb,


quase 2 vezes o tamanho das inserções clonáveis num fago λ.

• Assim, quando um cosmídeo é utilizado como vetor, apenas


são necessários 350.000 recombinantes para se atingir 99%
de probabilidade de uma seqüência de cópia única estar
presente numa biblioteca genômica de mamífero.
Biblioteca genômica:
fagos X cosmídeos
• As bibliotecas de cosmídeos são mais difíceis de construir e de
manter que as bibliotecas de fagos.

• Os cosmídeos são utilizados quando o gene de interesse é muito


grande ou quando se deseja uma região extensa de DNA.

• O uso de vetores λ é mais recomendado no isolamento rotineiro de


segmentos de genes ou em circunstâncias em que a biblioteca vai ser
utilizada muitas vezes.

• O método utilizado para isolamento de clones genômicos específicos


tem sido freqüentemente o de rastreio por hibridização com
uma sonda, normalmente uma sonda de cDNA. A amplificação direta
de fragmentos de DNA por PCR é agora igualmente comum.
Vetores utilizados na construção de
uma biblioteca de cDNA
• Após ter sido obtido o cDNA, é necessário prepará-lo para ser inserido
num vetor de clonagem, processo que depende do vetor
escolhido: plasmídio ou fago.

• O fago é mais utilizado devido à sua elevada eficiência:


comparativamente com os plasmídios, o fago requer cerca de 16 vezes
menos cDNA por μg do vetor para produzir um número equivalente de
clones recombinantes. Portanto as bibliotecas de fagos são mais fáceis de
manipular que as bibliotecas de plasmídios.

•Considerando que as moléculas de cDNA representam o mRNA total de


um organismo ou tecido específico, estas bibliotecas são muito úteis para
obter genes diferencialmente expressos. Para isso, procede-se ao
isolamento de genes expressos apenas em determinados tecidos, ou de
genes expressos em estágios específicos de desenvolvimento ou em
determinadas condições ambientais.

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