Enzimas en el análisis de

alimentos.
P. Glorio
Naturaleza de las proteinas y
enzimas.
Estructura
Primaria.

Azul: Interacciones hidrofóbicas; Rojo: Interacciones electrostáticas; Gris: enlace

hidrógeno; Verde; enlace disulfuro Fuente: Paul R. Mathewson, Enzymes Handbook
 Estructuras Proteicas Secundarias.

Fuente: Paul R. Mathewson, Enzymes Handbook

Estructuras terciarias y cuaternarias

Fuente: Paul R. Mathewson, Enzymes Handbook

Representación de una
reacción enzimático.

Fuente: Paul R. Mathewson,

Enzymes Handbook
• Reacción enzimática en la
que se observan las etapas
catalíticas y de unión al
substrato.

Fuente: Paul R. Mathewson,

Enzymes Handbook
Factores que afectan las velocidad de
las reacciones enzimáticas.

•Temperatura
•pH
•Desnaturalización.

Fuente: Paul R. Mathewson, Enzymes Handbook

Efecto del pH y la Temperatura

Fuente: Paul R. Mathewson, Enzymes Handbook

Desnaturalización de estructura nativa.

Fuente: Paul R. Mathewson, Enzymes Handbook

Efecto de la concentración

Fuente: Paul R. Mathewson, Enzymes Handbook

Métodos para medir actividad enzimática

Pueden estar basados en:

•Espectrofotometría. Cambios en
absorbancia.
•Reología. Cambios en viscosidad
•Potenciometría. Cambios en pH.

Fuente: Paul R. Mathewson, Enzymes Handbook

 Peroxidasas
• Burnette, 2007 revisa la reacción de la peroxidasa como sigue:
AH2: Donador de hidrogeno.
• ROOH + AH2 H2O + ROH + A
• H2 O2 + peroxidasa H20 + 0

• Pertenece al grupo de enzimas llamadas oxidoreductasas.

• Contribuye al color y sabor desagradable en vegetales no blaqueados
como las raíces y tubérculos.
 Sobre peroxidasa
• Se encuentra también en Leche.
• En vegetales cataliza de manera no específica la oxidación de un número
grande de compuestos fenólicos y anillos aromáticos encontrados en
productos vegetales.
• También reacciona con algunos acidos grasos pero solo de determinado
tamaño de cadena. (13 – 14)
• Se ha sugerido rol en detoxificación del vegetal.
Algunas reacciones de la peroxidasa
Monitoreo actividad de peroxidasa.
 Monitoreo actividad de peroxidasa.
• Tetraguaiacol tiene una absorbancia máxima alrededor de 450 nm.
• Para monitorear la actividad de la peroxidase se pueden medir los
incrementos en absorbancia a 450nm. A mayor absorbancia mayor
actividad de la enzima.

Posibilidad de uso de un
Microplate reader en el
monitoreo
De la absorbancia.
Típica placa de micropozos.
Técnica Elisa: Lectura

Lector de absorbancia para

placas de micropozos.
 Método enzimático para Glucosa

• Un método enzimático usa la enzima Glucosa oxidasa, la cual cataliza la

oxidación de la Glucosa hasta peróxido de hidrógeno, el cual reacciona
con un tinte en presencia de una segunda enzima la peroxidasa,
generando un producto coloreado estable. La absorbancia del color es
medida a 540 nm.
 Glucosa oxidasa
• Reacción con glucosa oxidasa
Sobre enzimas utilizadas para reducir glucosa

• Glucosa oxidasa reduce la cantidad de glucosa produciendo peróxido

y gluconato.
• El peróxido se puede eliminar posteriormente con la adición de
enzima catalasa quien lo transforma en agua.
• Forma de prevención pardeamiento de tipo no enzimático, ejemplo
en claras de huevo destinadas a deshidratación.
 Métodos enzimáticos Kits

• Existen Kits con todos los reactivos estandarizados para la reacción

enzimática los que se obtienen de compañías tales como las de:
• R-Biopharm.
• Megazyme
• Sigma-Aldrich
• Los protocolos para los métodos enzimáticos se deben seguir de forma
estricta.
Métodos enzimáticos permiten analisis de
otros azúcares
• La bibliografía publica un número variado de métodos enzimáticos
para en análisis de azúcares diferentes a la glucosa, tales como
galactosa, glucitol, manitol, xylitol.
• También con métodos enzimáticos se puede analizar: celulosa
galactomananas, almidón y pectina. No se recomienda para almidón
resistente y de alto contenido de amilosa.
 Muestra Liofilizada, duplicada (1 g) + 50 ml Buffer fosfato + 0.1 ml α-amilasa
(ph=6.0±0.1)
Incubar a 95º C x 15 min

Ajustar ph =7.5±0.1 con 10 ml NaOH (0.275 N) + 0.1 ml de Proteasa

Incubar a 60º C x 30 min

Ajustar ph =4.5±0.1 con 10 ml HCl (0.325 N) + 0.1 ml de
Amiloglucosidasa

Incubar a 60º C x 30 min

Centrifugación

3000 x 15 min

Filtración Sobrenadante
0.5 g. Celite seco a 130º C x 1h. (Adicionar agua hasta 100 g)
METODO OFICIAL Humedecer para filtrar con agua Añadir 400 ml etanol 95% a 60º C

A.O.A.C. 991.42 y Lavado

1-6 h

Precipitación
993.19: FIBRA (10 + 10 ml agua)
1h

DIETARIA METODO Secado

Filtración
0.5 g. Celite seco a 130º C/1h
Sobrenadante
(descartar)
ENZIMATICO (70º C toda la noche
ó 105º C x 5 h)
Humedecer para filtrar con EtOH 78%

GRAVIMETCO Pesado Lavado

(Etanol 78% 20 ml 3 v., Etanol 95%
10 ml 2v. Acetona 10 ml 2v.)
2 Residuos

Secado y Pesado
(P) Proteinas (Kieldahl) (C) Cenizas

2 residuos
Residuo-P-C-Blanco =
Fibra

Insoluble
(P) Proteina (Kieldahl) (C) Ceniza

Residuo-P-C-Blanco = Fibra Soluble

FIBRA DIETARIA TOTAL = Fibra Insoluble + Fibra Soluble

Determinación del
grado de
gelatinización.
Lipoxigenasas
Enzima muy importante en monitorear
el escaldado de vegetales, algunos
autores la prefieren a la peroxidasa.

(Mathewson, 1998)
Metallo enzima, contiene Fe
Sobre lipoxigenasa
• Metaloenzima que contiene hierro, actúa sobre ácidos grasos
que contienen estructura cis, cis penta 1, 4 dieno. Ej acidos
linoleico, linolenico, araquidonico.
• Dos tipos de lipoxigenasa, las que oxidan en ácidos grasos
libres tipo I y las que oxidan en ácidos grasos que están dentro
de estructuras de triglicéridos: tipo II.
• Lipoxigenasa tipo II también oxida carotenoides y clorofila
resultando en la pérdida de color de estos pigmentos. En
harina de trigo tienen un efecto blanqueador.
 Métodos para medir actividad de
lipoxigenasa en extractos de plantas.
• Uno de ellos es:

• Monitorear la perdida del sustrato (acido graso)

• Monitorear toma de oxígeno. (método manometrico, electroquimico o de
titulación)
• Monitorear la aparición del dieno conjugado a 234 nm.
Polifenoloxidasas
Sobre Polifenoloxidasa

• Son un grupo de enzimas que se encuentran de manera natural en la

mayoría de las plantas. (EC 1.10.3.1, 1.10.3.2 y 1.14.18.1)
• Dentro de los tejido estan alejadas del oxígeno, cuando se produce
un corte, ellas inducen la oxidación de compuestos fenólicos tales
como el catecol, fenoles substituidos y aminoácidos tirosina.
• Producen melanina, un pigmento que puede reaccionar con
proteinas.
(Tate et al, 1964)
 Prevención reacciones con polifenoloxidasa
• Uso de antioxidantes cono ácido ascórbico.
• Reducción de pH
• Metaloenzima que requiere de Cu. Los compuestos sulfurados (dioxido
de azufre y otros) inhiben ya que se unen al Cu.
• Temperaturas de 95°C
• Presencia de superoxido dismutasa en algunos productos. Estabiliza
anion superoxido (O2-). Retarda pardeamiento enzimatico. Estabiliza A
ascórbico.