UNIVERSIDAD NACIONAL DEL ALTIPLANO

Facultad de Medicina Veterinaria y

Zootecnia
Escuela Profesional de Medicina Veterinaria y Zootecnia

PATOLOGIA CLIINICQ

TECNICA DE ELISA
CONDORI MORALES , Ronnie Mask
IMPORTANCIA
 La evolución e introducción de variantes de la técnica
de ELISA, así como la disminución progresiva de sus
costos unitarios, le han convertido en una valiosa
herramienta para la detección y/o diagnostico de
enfermedades
 En el estudios serológicos, hematológicos,
endocrinológicos, oncológicos, en trasplantes
 Sus resultados aportan elementos diagnósticos,
información de una enfermedad y coadyuvan en
planificación del tratamiento
 Diagnostico Medico, Industria de alimentos y estudio y
control del medio ambiente
MARCO TEÓRICO
El ELISA se basa e el uso de antígenos o anticuerpos
marcados con una enzima, de forma que los
conjugados resultantes tengan actividad tanto
inmunológica como enzimática. Al estar uno de los
componentes (antígeno o anticuerpo) marcado con
una enzima e insolubilizado sobre un soporte
(inmunoadsorbente) la reacción antígeno-anticuerpo
quedará inmovilizada y, por tanto, será fácilmente
revelada mediante la adición de un substrato
especifico que al actuar la enzima producirá un color
observable a simple vista o cuantificable mediante
el uso de un espectrofotómetro o un colorímetro.
Antigenos:
> Generadores de anticuerpos
> Incluye: proteínas, polisacáridos y varias
moléculas pequeñas, que estimulan la producción
de anticuerpos.
Anticuerpos:
> Respuesta del organismo ante la presencia de
un agente infeccioso
> Son moléculas proteicas secretadas por los
plasmocitos
> los anticuerpos usados en la ELISA son de
origen monoclonal o policlonal
APLICACIONES DEL ELISA
> Patología Animal Rotavirus
 Enfermedades producidas por parásitos Artritis vírica
Babesias y tripanosomas Otras aplicaciones
Toxocara canis Hormonas
Toxoplasmosis Gonadotropina coriónica
Triquinosis Progesterona
 Enfermedades producidas por Micoplasmas Testosterona
Enfermedades producidas por bacterias Hormonas tiroideas
Mycobacterium tuberculosis Cuantificación de inmunoglobulinas
Brucelas IgG
Enterotoxinas Vibrio cholerae IgE
Estreptococos IgA
Salmonelas Inmunopatología
Enfermedades producidas por virus Anticuerpos anti-DNA
Enfermedad de Aujeszky Factor reumatoide
Enfermedad de Newcstle Inmunocomplejos circulantes
Fiebre aftosa
Leucemia felina
Peste porcina africana
Peste porcina clásica
Rinotraqueitis infecciosa
TIPOS DE ELISA
Los diferentes tipos de ELISA son los que se
enumeran a continuación:
• Anticuerpos marcados:
 ELISA Directo
 ELISA Indirecto
 ELISA sándwich
 Doble (DAS)
 Heterólogo (HADAS) Todos los tipos de ELISAs descritos se
• Antígeno marcado pueden resumir en dos grandes grupos:
• ELISAs para detectar antígenos: ELISAs
 ELISA competitivo sándwich.

• ELISAs para detectar anticuerpos: ELISAs

indirectos.
 MATERIALES

EQUIPOS

Microplacas de poliestireno Lector de placas de Lavador de placas de 96

de 96 pocillos 96 pocillos pocillos
MUESTRAS ENZIMAS

 SUERO  PEROXIDASA
 ORINA SALIVA  FOSFATASA ALCALINA
 ORINA  B-GALACTOSIDASA
 LCR  PENICILINASA
 HECES  UREASA
 OTROS  GLUCOSA OXIDASA

La enzima escogida debe unirse fácilmente a antígenos y anticuerpos,

encontrarse en un estado puro
SUSTRATO LAVADOS

 Solubles en agua  Buffer fosfato 0.01 a pH 7,2

 Fácil de manipular  Solución salina con Tween
 No tóxicos, no mutagénicos 20
 Bajo costo
PROCEDIMIENTO
Pasos generales de un ELISA.
 1. Tapizado del pocillo con el antígeno o anticuerpo.
 2. Adición de la muestra problema con la mezcla de antígenos o
anticuerpos.
 3. Unión del antígeno o anticuerpo específico al anticuerpo o
antígeno tapizado en el pocillo
 4. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antígeno o
anticuerpo no unido
 5. Adición del anticuerpo secundario marcado con la enzima
 6. Unión del anticuerpo secundario al antígeno o anticuerpo
 7. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida
 8. Adición del substrato
 9. Unión del substrato a la enzima
 10. Desarrollo del color
ELISA DIRECTO

En este modelo, el Ac específico para el Ag de interés, se encuentra adsorbido en un

soporte sólido (placa de petri), sobre el que se añadirá la muestra biológica. En el caso
de que en dicha muestra se encuentre el Ag, quedará capturado en la placa y será
puesto en evidencia tras la adición de otro Ac específico conjugado con la enzima. Por
último, se añade el substrato sustrato incoloro que, por acción de la enzima, dará un
producto coloreado que producirá un color observable a simple vista y cuantificable
mediante un espectrofotómetro.
ELISA INDIRECTO
Para la determinación de Acs
específicos para un
determinado Ag se utiliza
normalmente la modalidad
de ELISA indirecto en donde
el Ag de interés se encuentra
adsorbido en la placa de
ELISA. Se pueden utilizar
como antígenos, proteínas
virales o bacterianas e
incluso virus completos, pero
cada día es más frecuente
adsorber exclusivamente las
proteínas de interés
inmunológico. Esta es una de
las técnicas de elección para
buscar Acs contra proteínas
del virus VIH en sueros de
pacientes
ELISA SANDWICH «DAS»

• Adición de anticuerpos específicos del

antígeno a detectar (deben tener un epítopo
diferente de los anticuerpos con los que se han
tapizado el soporte) conjugados con una enzima,
los cuales reaccionan con los antígenos añadidos
con la muestra problema y que se encuentran
fijados a los anticuerpos. Lavado para eliminar
los anticuerpos marcados que no hayan
reaccionado.
ELISA “HADAS”

• Adición de anticuerpos específicos del antígeno a

detectar (deben tener un epítopo diferente de los
anticuerpos con los que se han tapizado el soporte),
los cuales reaccionan con los antígenos añadidos
con la muestra problema y que se encuentran
fijados a los anticuerpos. Lavado para eliminar los
anticuerpos que no hayan reaccionado.

• Adición de anticuerpos conjugados con una

enzima anti-anticuerpos empleados en el paso
anterior. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos
marcados que no hayan reaccionado.
ELISA COMPETITIVO.

• Adición en concentración conocida de una mezcla de antígenos del

anticuerpo utilizado en el paso anterior, marcados con una enzima y
antígenos desconocidos objeto de estudio. Paralelamente, añadir
únicamente antígenos del anticuerpo usado en el paso anterior,
marcados con una enzima. Lavar para eliminar los antígenos que no
hayan reaccionado.

• Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado de ambas

pruebas y comparar los resultados. Si las lecturas de ambas pruebas
son análogas, el antígeno a estudio no tienen nada que ver con los
anticuerpos empleados para tapizar el soporte. Si hay diferencia en las
lecturas de ambos pocillos, el antígeno objeto de estudio, está
relacionado serológicamente con el anticuerpo empleado para tapizar el
soporte y la diferencia de densidad óptica, es proporcional a la
concentración del antígeno problema en la muestra.
EJEMPLOS

El suero a examinar se coloca en un micro-pocillo recubierto con

antígenos de Leishmania.

En caso de positividad, se aprecia una reacción colorimétrica

cuantificable mediante espectrofotómetro y, por tanto, no sujeta a una
variabilidad subjetiva ligada al operador.

Es una prueba con una especificidad y sensibilidad media-alta (70-

100%). La sensibilidad es mucho más elevada si se utilizan múltiples
antígenos de Leishmania, con lo que aumenta el número de lugares
donde se pueden fijar los eventuales anticuerpos presentes en el suero
[7,8,10-12]. Además, permite cuantificar los anticuerpos específicos
CONCLUSION
Facilidad de las pruebas:
 Disponibilidad comercial
 Posibilidad para crear varios anticuerpos primarios
en una especie dada y utilizar el mismo anticuerpo
secundario para la deteccion
Rapidez de las pruebas
 Se obtienen resultados rápidos y exactos
Sensibilidad
 La prueba directa de Elisa es menos sensible que
la forma indirecta
WEBGRAFIA
 www.cultek.com/inf/otros/soluciones/Soluciones-
ELISA-protocolos.pdf
 www.higiene.edu.uy/parasito/trabajos/elisa.pdf
 www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/inmunoquimica.p
df
 cnia.inta.gov.ar/helminto/pub%20triquinosis/ELISAtrich
inella.pdf
 www.medic.ula.ve/idic/docs/clases/practica_bouchard.
pdf
 www.finlay.sld.cu/.../Tecnicas%20inmunoenzimaticas%
20para%20ensay