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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS EXTAS


BACHARELADO EM QUÍMICA

DETECÇÃO DAS PROTEÍNAS DO


LEITE POR MEIO DE RP-HPLC

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Por: Bárbara Paula e Hemerson Pataxó
INTRODUÇÃO

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LEITE Cromatográficas e
Electroforéticas

RP - HPLC

Água, proteínas,
lactose, gordura α-lactalbumina (α-La) e β-
e compostos caseína (β-CN),
inorgânicos lactoglobulina (β-lg),kappa-
caseína (κ-CN) e αS -caseína
(αs-CN) 4
METODOLOGIA

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Preparo de Amostra

α-lactalbumina (α-La) e β- Diluídas com tampão 100 ml da mistura


caseínaB (β-CN), α-La e β- fosfato 50 µmol L-1 (pH foram diluídos com 3,7
lactoglobulina (β-lg), caseína 6,8) e solventes A* e ml do tampão e
(κ-CN) e αS -caseína (αs-CN) B** (70:30) solventes.

Foram preparadas misturas de padrões com


Injetada na coluna proporção semelhante as proteína do leite
C-18 RP-HPLC (caseínas 80% e 20% de proteínas de soro de
leite)
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*:acetonitrilo, água e ácido trifluoroacético numa proporção de 100: 900: 1 (v / v / v). **: acetonitrilo, água e ácido trifluoroacético numa proporção de
900: 100: 1 (v / v / v).
Preparo de Amostra
Diluiu 2 mL de amostra O sólido foi acidificado com
em 20 mL Água com tampão de sódio/acetato
Amostras de leite in
tampão sódio/acetato com 1,0 µmol L-1 (pH 4,3)
natura e pasteurizado
pH 4,3 seguido de seguido de nova
centrifugação. centrifugação.

Às fracções de caseína
dissolvidos das amostras de Após pré-
Ao sólido novamente adicionou-se leite foram diluída em tratamento as
tampão de fosfato e a mistura foi diferentes soluções amostras foram
dissolvida num sonicador. (tampão fosfato; tampão injetadas em RP-
fosfato 0,1% TFA e mistura HPLC. 7
das soluções A e B)
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HPLC - 1290 Infinity II LC System (Agilent)


Condições
Cromatográficas
Sistema da série bomba quaternária bloco de injeção manual
HPLC Agilent (Agilent, G1311A) (Agilent, G1328B)

termostato de coluna UV-detector (Agilent, G1314A) comprimento


(Agilent, G1316A) de onda variável

O software (Agilent ChemStation) associado


desgaseificador ( Agilent,
ao equipamento foi utilizado para controle de
G1379A)
processamento de gradiente do solvente

Uma coluna C-18 RP-HPLC com suporte em


E todas as soluções foram filtradas
sílica com tamanho de partícula de 5 µm,
através de um filtro de nylon.
tamanho do poro 30 nm) 9
Condições
Cromatográficas
Sistema da série Tempo total de execução; Temperatura da
HPLC Agilent 30 minutos coluna 25 °C

Comprimento de onda de
Fluxo 1,0 mL/min
detecção 220 nm

Um programa de gradiente de solvente iniciou


a 20% de solvente B, e que foi gerado
imediatamente após a injeção da amostra, Volume de injeção de solução
aumentando a proporção de solvente B a 46% de amostra final 20 mL
no final da corrida. E então ele foi devolvido às 10
condições iniciais em 2,4 minutos.
RESULTADO DE DISCUSSÃO

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Figura 1 - Os cromatogramas das caseínas obtidas do leite in natura diluídos com a mistura de
solventes A e B (70:30) (a), diluição com tampão de fosfato (b), e leite pasteurizado diluídos nas
soluções A e B (70:30) (C), diluição com tampão de fosfato (d). identificações de pico são 12

mostrados; 1 = κ-caseína, 2 = a-caseína, 3 = β-caseína.


Figura 2. Cromatogramas de proteínas de soro de leite pasteurizado (sem diluição) (a),
leite in natura (b). Identificações de pico são mostrados; 1 = α-lactalbumina, 2 = β- 13

lactoglobulina.
Figura 3. Cromatograma de proteína do soro do leite diluição com solvente A e B (70:30) (a), e
sem diluição (b). Identificações dos picos mostrados: 1 = α-lactalbumina, 2 = β-lactoglobulina.
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Figura 4. Os cromatogramas obtidos a partir de leite desnatado na separação da caseína
diluídos com tampão fosfato (a), diluição com tampão de fosfato continha 0,1% de ácido
trifluoroacético (b), diluição com mistura do solvente A e B (70:30) (c). Identificações dos 15

picos: 1 = κ-caseína, 2 = a-caseína, 3 = β-caseína.


Figura 5. Separação dos padrões de proteínas de leite bovino purificado por RP-HPLC. (A): k- 16
caseína, (b): a-caseína, (c): p-caseína, (d): a-lactalbumina, (e): p-lactoglobulina.
Figura 6. Separação de proteínas de leite in natura (a) e pasteurizado (b) As amostras de leite
desnatado diluído com solvente A: solvente B (70:30) mistura por RP-HPLC. identificações de pico são17
mostrados; 1 = κ-caseina, 2 = a-caseína, 3 = α-lactalbumina, 4 = β-caseína, 5 = β-lactoglobulina.
Figura 7. Separação de proteínas padrão misturado dos padrões diluído com solvente A e B (a);
Misturas de padrões ajustadas para proporção de leite desnatado original, (b). Identificações dos
picos: 1 = κ-caseina, 2 = a-caseína, 3 = α-lactalbumina, 4 = β-caseína, 5 = β-lactoglobulina.
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CONCLUSÃO

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• Velocidade da separação (gradiente);
• Tratamento de amostra;
• Solubilidade das Proteínas;
• Separação da Caseína;
• Perspectivas;

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REFERÊNCIAS

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• Conselho Regional de Química IV Região (SP), 2010.

• Skoog, D. A.; West, D. M.; Holler, F. J.; Crouch, S. R.


"Fundamentos de Química Analítica". Pioneira São Paulo. 2006.

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