CROMATOGRAFIA

INTRODUCCION
 Cromatografía
Tiselius (1906) empleó por primera vez el término
"cromatografía",
chroma y graphein = "color" y "escritura“

Técnica analítica que separa, identifica y cuantifica

los componentes de una muestra que se
distribuyen entre dos fases.

Una fase móvil (gas, líquido o fluido supercrítico)

que arrastra a la muestra a través de una fase
estacionaria sólida o líquida.
La separaciones se basan en las velocidades de
desplazamiento diferencial de los solutos que se
mueven entre las dos fases a distintas velocidades.
 Interacción analito con la FM y FE
Fuerza conductora para la migración: Fluido en movimiento
Fuerza resistiva: Afinidad del soluto por la fase estacionaria

Los componentes a
separar deben ser solubles
en la FM y capaces de
interaccionar con la FE
(disolución, adsorción,
intercambio, etc,)
 Clasificación
Por la Fase Estacionaria

Cromatografía Plana: La fase estacionaria se sitúa

sobre una placa plana de aluminio, vidrio, plástica ó
sobre un papel.
Las principales técnicas son:
o Cromatografía en papel
o Cromatografía en capa fina

Cromatografía en columna: La fase estacionaria se

sitúa dentro de una columna (tubo)
 Clasificación
Por la Fase Móvil:
o Cromatografía de líquidos
Liquido - Sólido (adsorción)
Líquido - Líquido (partición)
o Cromatografía de gases
Gas - Sólido y Gas - Líquido
o Cromatografía de fluidos supercríticos
Cromatografía Líquida
Fase Normal: Fase estacionaria polar
Fase Reversa: Fase estacionaria apolar
Intercambio Iónico: Cationes y aniones
Permeación en gel o Exclusión por tamaño:
Moléculas de gran tamaño (proteinas)

El conocimiento de la estructura molecular de los

componentes de la muestra permite una buena
selección del método de cromatografico
Por el mecanismo de Retención y
Separación
Toma en cuenta el equilibrio implicado en
la transferencia de los solutos entre la
fase movil y estacionaria.
* Cromatografía de reparto y adsorción
•Cromatografía de afinidad, exclusión y
CII.
* Electrocromatografia (electroforesis)
 Técnica Fase móvil Fase estacionaria
Cromatografía de gases Gas Sólido o líquido

Cromatografía líquida Sólido o líquido

Líquido (polar)
en fase inversa (menos polar)

Cromatografía líquida Líquido Sólido o líquido

en fase normal (menos polar) (polar)

Cromatografía líquida
Líquido (polar) Sólido
de intercambio iónico

Cromatografía líquida
Líquido Sólido
de exclusión

Cromatografía líquida
Líquido Sólido
de adsorción

Cromatografía de
Líquido Sólido
fluidos supercríticos
 Adsorción
El analito se distribuye en una FE sólida
(adsorbente) y una FM líquida (eluyente).
El factor más importante: Polaridad
La cromatografía de adsorción separa mejor
compuestos que difieren en gran medida de su
polaridad.
En Adsorción, la separación depende de las
interacciones entre el soluto, la superficie
adsorbente y la fase móvi.

Las moléculas quedan

retenidas por un sólido
de elevada superficie
específica
 Partición o Reparto
El analito se distribuye entre dos líquidos
(FE líquida y FM líquida)
La separación depende del reparto entre las
dos fases líquidas (FM y FE).
El factor más importante: La mayor
solubilidad entre una de las dos fases
líquidas.
La técnica de cromatografía L–L es mejor
para la separación de series homólogas,
mezclas de baja concentración, elución de
sustancias polares por fase reversa.
 Partición
La separación se logra igualando la
polaridad de la fase móvil con la muestra y
utilizando una fase estacionaria con una
polaridad diferente

La fase estacionaria
es un líquido sobre
un soporte sólido
 Adsorción o partición
Los grupos funcionales que son capaces de
formar enlaces de hidrógeno fuertes se
retienen mucho en cromatografía de
adsorción.

Partición proporciona una alternativa para

la separación compuestos que tienen
polaridad media y son solubles en
disoluciones orgánicas débilmente polares.
 Fases Estacionarias
Adsorción: Alúmina, sílica gel, silicato de
magnesio, poliamida, carbonato de calcio,
acetato de celulosa.

En reparto se usan soportes, sustancias

capaces de retener la fase estacionaria
líquida e inerte hacia la fase móvil y los
componentes de la muestra: Sílica gel
desactivada con agua, tierra de diatomeas,
celulosa.
 Sílica gel
Grupo adsorbente –OH
Fase móvil debilita unión y desplaza la molécula al
siguiente –OH
A > No. de etapas sucesivas (platos teóricos), >
posibilidad de separación de compuestos con
diferente carga.
Selección de la Fase Movil
En reparto, la selección de la FM es crucial
para una buena separación (Escala de
Hildebrand)
Además de la solubilidad entre dos
líquidos, el reparto también se ve afectado
por pequeñas diferencias entre los pesos
moleculares. Preferible para separar series
homólogas.
Fase normal: En cromatografia de partición se utiliza una
FE polar y un solvente orgánico no polar, como: n-hexano,
cloruro de metileno, cloroformo (como FM).
La FE es un grupo funcional siloxano enlazado con un
grupo funcional polar. Los grupos funcionales más
comunes en orden de polaridad creciente son:
cyano: -C2H4CN
diol: -C3H6OCH2CHOHCH2OH
amino: -C3H6NH2

dimethylamino: -C3H6N(CH3)2
 Fase Reversa
FM mas polar que FE
70% de las separaciones
FM: agua-metanol, agua-acetonitrilo

Mecanismos:
 Adsorción

 Reparto

 Tensión Superficial

Muestras insolubles o moderadamente solubles

 Hidrocarburos aromáticos, aceites, esteroides,
polìmeros, plàsticos, alcaloides
Fase Reversa: La cromatografia de particion
usa FE relativamente no polar y una FM polar
(metanol, acetonitrilo, agua, o una mezcla de
estos solventes).
Las fases más comunes: n-octadecilo (C18),
n-octilo (C8) y grupos fenilos.
La cromatogrfia de fase reversa tiene mayor
aplicación de las cromatografias líquidas, por el
mayor rango de analitos que se pueden disolver
en la fase movil.
 Fases enlazadas
Unión covalente de un soporte sólido a un medio
orgánico para obtener una FE con diferente
polaridad y con características de cromatografía
líquido-líquido, pero que mantenga la
estabilidad de un sistema sólido-líquido.
Mejor separación de mezclas
Mayor eficacia
Mejor resolución
Parámetros Cromatográficos
Coheficiente de distribución: Distribución de
un compuesto entre dos fases inmiscibles.
K=Cs/Cm
Tiempo de Retención: Tiempo que transcurre
para que el analito alcance al detector (tR),
salga de la columna
Tiempo Muerto
Tiempo necesario para que la especie
no retenida alcance al detector (tM)
Factor de Capacidad
Describe las velocidades de migración de los
analitos en las columnas. K´ ideal = 1 y 5
K´A = K A * Vs/Vm ó K´A = tR - t M/ t M
a > K´ tiempos de retención largos
a < K´ tiempos de retención cortos
Factor de Selectividad
Describe las velocidades relativas de
migración de dos analitos
X=KB/KA
Valor ideal = 1 y 2
 Eficiencia/Eficacia
Grado de ensanchamiento de bandas que
experimenta un compuesto a través de la
columna (pico delgado y angosto)
Se expresa No. de platos teóricos
N = L / H (altura equivalente de plato teórico HETP)
Puede evaluarse con ecuación Van Deemter
H = A + B/u + Csu + Cmu
A = Difusión turbulenta (depende del diámetro de las
partículas de relleno)
B = Difusión Molecular Longitudinal (migración del soluto
desde el centro más concentrado a las más diluidas)
predomina a bajas velocidades de flujo de FM
C = Transferencia de masa (equilibrios del soluto entre FM y
FE)
 Resolución
Capacidad de una columna para separar dos analitos.
Depende de la elección de FM, FE, L y Temperatura

Valor ideal = 1.5 (separación completa)

Rs = 2(tR2 - tR1) / (w1 + w2)
 Desarrollo cromatografico
Cromatografía de Elusión
Procedimiento en el que la FM se pasa de
forma continua a través o a lo largo de la
columna con polaridad constante.
Si la polaridad o el pH cambia durante el
proceso de separación se le llama
Cromatografía de elución con gradiente
Cromatografía Frontal
Procedimiento en el que la muestra
analizada se alimenta de forma continua a
la columna. No se utiliza ninguna fase
móvil adicional.
Cromatografía por desplazamiento
Procedimiento en el cual la FM contiene
un compuesto (agente desplazante) que
es retenido más fuertemente que los
componentes de la muestra analizada.

En cada una se aplica poca muestra al

sistema en forma discreta y rápida.