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UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA

CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA NATUREZA


PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR

MULTIPLE GENOTYPING BASED ON


MULTIPLEX PCR AND MICROARRAY
CCL – Chinese Chemical Letters (2016)

X I A N - B O M O U ( 1 ) , Z E E S H A N A L I ( 1 ) , B O L I ( 1 ) , TA O - TA O L I ( 1 ) , H U A N Y I ( 1 ) , H O N G - M I N G
D O N G ( 2 ) , N O N G - Y U E H E ( 1 ) , YA N D E N G ( 2 ) , X I N Z E N G ( 3 )

Anderson Felix
Beatriz Dantas Guimarães

JOÃO PESSOA
2018
Mutações Genéticas Desenvolvimento de Doenças Estudo de SNPs  novos marcadores
Desenvolvimento de métodos de genotipagem múltiplos SNPs (loci)

Tumores  geralmente frequência alélica alterada em mais de um locus


Amplificação de diferentes loci de SNP

Esferas magnéticas  funcionalidade + pequeno tamanho + fácil separação


Combinada a técnicas bioquímicas

MULTIPLEX PCR
Placas de vidro  plataforma para microarranjo  fixação de sondas
de hibridização
Diagnósticos de doenças
Proteção ambiental e agricultura moderna
Expressão gênica
Rapidamente e
Detecção de mutações
precisamente analisar
Biblioteca genômica inúmeros genes
simultaneamente
Análise de polimorfismos
Objetivo

Desenvolvimento
de método de
genotipagem
múltipla

multiplex-PCR
com esferas microarranjo
magnéticas
4 SNPS SELECIONADOS  ASSOCIAÇÃO CÂNCER GÁSTRICO

M235T e A-6G loci  gene AGT (angiotensina)


A1298C e C677T loci  gene MTHFR (metilenotetrahidrofolato redutase)

4 PARES DE PRIMERS PROJETADOS

Amplificação sequências-alvo com SNP loci

MULTIPLEX-PCR COM ESFERAS MAGNÉTICAS

S-adenosyl methionine  doador de grupos metil


Metilenotetrahidrofolato  Metiltetrahidrofolato
Sondas de detecção (Microarray) 
fixadas nas placas de vidro

Produtos de PCR  transferidas para as


placas  SONDAS  hibridizaão

Microarranjo  examinado pela Capital


Bio Technology (China); intensidade de
fluorescência

Genótipo dos SNPs loci  identificados


pela LOCALIZAÇÃO e INTENSIDADE DE
FLUORESCÊNCIA no microarranjo
MATERIAIS E PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS
Amostras de câncer gástrico  Shanghai Jiaotong University (Shangai)

Extração do DNA  Sistema de extração automática desenvolvida pelo grupo

Todos os oligonucleótidos foram sintetizados e HPLC purificada por Sangon Biotech (Shanghai)

Polimerase TaqDNA e outra polimerase reagentes de reação em cadeia (PCR) foram obtidos de TaKaRa

A lâmina de vidro modificada CHO foi comprada da CapitalBio

O processo de hibridização foi realizado em uma incubadora (projetado pelo nosso grupo).

A intensidade de fluorescência na lâmina de vidro foi medido por LuxScan-10K / A (CapitalBio, China).
FABRICAÇÃO E MODIFICAÇÃO DAS ESFERAS MAGNÉTICAS

Fabricadas no grupo
Caracterizadas por microscopia eletrônica
Tetraetoxisilano (TEOS)  revestir camada de SiO2 na superfície das esferas  oxidação
Fixação de sondas na superfície (MB@SiO2)  esferas com sondas

**MB@SiO2  SiO2 magnetic beads


PCR MULTIPLEX

3 Amostras de CA Gástrico

PCR multiplex  realizado em 1 tubo

Templates + sondas das esferas  incubadas 30min em temperatura conveniente 


assegurar hibridização Templates <-> Sondas das esferas

4 pares de primers  selecionar as sequências

Solução tampão  obter ssDNA (DNA de cadeia simples) da superfície das sondas

Eletroforese em gel de agarose


PCR MULTIPLEX
Single Template*
Um só tubo; um único template
Vários primers foward e reverso

Estágio 1  localizar e
amplificar os genes
específicos

Estágio 2  amplificar
fragmento a níveis
detectáveis

Amplificar diferentes regiões no mesmo template


Multiple Template

Um só tubo
Vários templates
Vários primers
Risco de erros (Templates  Primers)
Fixação De Sondas Na Lâmina De Vidro

Sonda foi preparada em


Solução de impressão
lâmina de vidro foi colocada em Lavadas em (SDS) várias
continha 10-30 mmol / L
caixa úmida a 37ºC por 12 horas vezes após a fixação
de dimetilsulfóxido
(DMSO) a 50% e
impressos
Encharcada em solução
salina com PBS/5min

Seca por N2 puro


Fabricação De Microarranjos Baseado Em Hibridização

gota a gota sobre a lâmina de vidro


96ºC
MISTURA DE HIBRIDIZAÇÃO
Produto PCR

composta por volumes iguais de


produtos de PCR multiplex
desnaturados e Buffer de Hibridização

Lâmina
transferida para
solução de incubada em temperatura em
lavagem I e ambiente controlado por 40 min
II/2min
FABRICAÇÃO E MODIFICAÇÃO ESFERAS MAGNÉTICAS
Aproximadamente esféricas
Diâmetro 300-400nm
Superfície áspera
Após revestimento SiO2 esferas mais lisas e regulares  melhor dispersão
Estudos mostram  esferas com sílica são mais adequadas que esferas sem cobertura

Naked Revestida com sílica


MULTIPLEX PCR
3 amostras de câncer gástrico  sequências-alvo amplificadas
4 loci  amplificadas com igual eficiência após ajuste proporção
Multiplex PCR para 3 amostras de cancer gástrico após ajuste de
C677T: M235T: A1298C: A-6G proporção de primers

1 : 0.7 : 1 : 1.5

4 bandas C677T
M235T
C677T M235T A1298C A-6G
A1298C
A-6G

375 pb 293 pb 265 pb 235 pb


Microarray Fabrication And Genotyping

Quando a razão
Quando a intensidade
entre sonda
de fluorescência da
selvagem / sonda
sonda selvagem / sonda
mutante era
mutante era maior
menor igual 0,35,
igual 3, o genótipo
o genótipo deste
deste locus / amostra
locus / amostra
foi identificado como Enquanto o genótipo deste locus / amostra foi identificado como foi identificado
tipo selvagem heterozigoto se o valor da sonda selvagem / sonda mutante
como tipo
estiver entre 0,8 e 1,2.
mutante
Os quatro loci produzidos sinal de fluorescência do mesmo,
porque a amostra em estudo era heterozigota para todos esses
loci
O locus M235T foi escolhido, como representante, para analisar o efeito
da temperatura de hibridização na genotipagem
Microarray Fabrication And Genotyping

C677T

M235T

A1298C

A-6G

*A amostra 1 foi genotipada como mutante no locus SNP no gene C677T enquanto as amostras 2 e 3 foram heterozigota para o mesmo
locus;
*As amostras 1 e 3 foram identificadas como tipo selvagem para ambos os loci no gene M235T e gene A-6G;
*A amostra 2 foi tipo mutante para o locus no gene A-6G;
*Todas as três amostras mostraram diferentes genótipos para o locus no gene A1298C
 Genótipos pode ser reconhecido pelos locais especificados na lâmina de vidro por razões
de fluorescência.
 As três amostras de câncer gástrico foram genotipadas para quatro loci SNP usando com
sucesso este método.
 No entanto, este método tem o potencial para ser usado para o highthroughput
Genotipagem de SNPs
UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA NATUREZA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR

MULTIPLE GENOTYPING BASED ON


MULTIPLEX PCR AND MICROARRAY
CCL – Chinese Chemical Letters (2016)

X I A N - B O M O U ( 1 ) , Z E E S H A N A L I ( 1 ) , B O L I ( 1 ) , TA O - TA O L I ( 1 ) , H U A N Y I ( 1 ) , H O N G - M I N G
D O N G ( 2 ) , N O N G - Y U E H E ( 1 ) , YA N D E N G ( 2 ) , X I N Z E N G ( 3 )

Anderson Felix
Beatriz Dantas Guimarães

JOÃO PESSOA
2018