Universidad de Talca

Facultad de Ciencias de la Salud

Dpto. Bioquímica Clínica e Inmunohematología.
Escuela de Tecnología Médica

Experimento 2.6. Ureogénesis en

cortes de hígado de rata.
Integrantes: Giorgio Cabrera.
Javiera Retamal.
Profesores: - Roxana Orrego.
- Sergio Wehinger.
- Paula Romero.
Fecha: 25/04/2017
UREOGÉNESIS

Urea
Ciclo de la Urea

Enzimas del ciclo de la urea:

1- Cabamoil fosfato sintetasa I.

2- Ornitina transcarbamilasa.
3- Arginino-Succinato
sintetasa.
4- Arginino-Succinato liasa.
5- Arginasa.
Regulación de la producción de urea

Mayor producción
urea

Dieta rica en Inanición

proteínas prolongada
Laboratorio
Objetivo: Reactivos generación urea: Solución de Krebs: Reactivos cuantificación urea:
 Solución de Krebs.  NaCl 0,154 M.  α-Isonitrosopropiofenona 3%.
• Evaluar la producción
 Solución de KCl 0,154 M.  KCl 0,154 M.  Mezcla sulfúrico-fosfórica.
de urea en cortes de
 Lactato de sodio 2%.  CaCl2 0,11 M. • H2SO4 concentrado.
hígado de rata, al variar
 Carbonato de amonio 1%.  MgSO4 0,154 M. • H3PO4 concentrado.
los componentes del
 Ornitina 1%.  Buffer Fosfato Sódico • Agua destilada.
sistema.
0,10 M pH 7,4.  Estándar de urea 10 mg/dl.

Cuantificación urea
Reacción de Archibald

Curva de calibración:
• Seis puntos, entre 0,02
– 0,08 mg urea/ml.
• Lectura a 540 nm.
Protocolos
1) Preparación de los medios de incubación:
Tubo Hígado Medio Sol. Sol. Carbonato de Sol. Ornitina Sol. Lactato de H20 (d) Vol.
Krebs amonio al 1% al 1% sodio al 2% final
1 0,2g completo 2,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0 ml 4 ml
2 0,23g Sin Krebs 0 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 2,5 ml 4 ml
3 0,22g Sin carbonato 2,5 ml 0 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 4 ml
4 0,23g Sin ornitina 2,5 ml 0,5 ml 0 ml 0,5 ml 0,5 ml 4 ml
5 0,21g Sin lactato 2,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0 ml 0,5 ml 4 ml

2) Curva de calibración:

Estándar Volumen Mezcla Sulfúrico- Sol. De α -isonitroso- Absorbancia a

Tubo Urea [mg/ml] H2O final
(10mg/dl) fosfórica propiofenona al 3% 540 nm
1 0,02 0,05 ml 0,2 ml 0,25 ml 2,5 ml 0,125 ml 0,077
2 0,028 0,07 ml 0,18 ml 0,25 ml 2,5 ml 0,125 ml 0,134
3 0,04 0,1 ml 0,15 ml 0,25 ml 2,5 ml 0,125 ml 0,183
4 0,06 0,15 ml 0,1 ml 0,25 ml 2,5 ml 0,125 ml 0,298
5 0,072 0,18 ml 0,07 ml 0,25 ml 2,5 ml 0,125 ml 0,378
6 0,08 0,2 ml 0,05 ml 0,25 ml 2,5 ml 0,125 ml 0,416
7 (BL) - - 0,25 ml 0,25 ml 2,5 ml 0,125 ml 0
Procedimiento

Giorgio Cabrera, 2017

 Resultados
Curva de calibración
Hígado Sol. De α- 0.45 Equipo: Metertech S.P 830 Plus.
Mezcla
Tiempo Medio de isonitroso- [urea]
sulfúrico- Absorbanci
Sistema Tubo incubación incubación
fosfórica
propiofeno
a a 540 nm
(µg/g 0.4 N° de serie: 83004342.
f(x) = 5.59x - 0.03
(minutos) (ml) na al 3% tejido) Fecha:R²28/03/2017
=1
(ml) 0.35
(ml)
0.3

Absorbancia
0,2g A 0’ 0,25 2,5 0,125 0,013 46,49 0.25
B 15’ 0,25 2,5 0,125 0,021 70,40
completo 0.2
C 30’ 0,25 2,5 0,125 0,048 150,19
D 40’ 0,25 2,5 0,125 0,082 238,25 0.15
0,23g A 0’ 0,25 2,5 0,125 0,004 12,44 0.1
Sin solución B 15’ 0,25 2,5 0,125 0,017 49,56
de Krebs 0.05
C 30’ 0,25 2,5 0,125 0,058 157,81
D 40’ 0,25 2,5 0,125 0,064 161,69 0
0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09
0,22g Sin Carbonato A 0’ 0,25 2,5 0,125 0,008
26,00
de amonio B 0,25 2,5 0,125 0,028 Concentración de Urea (mg/ml)
15’ 85,34
C 30’ 0,25 2,5 0,125 0,055
156,45
D 40’ 0,25 2,5 0,125 0,064
169,05
0,23g Sin Ornitina A 0’ 0,25 2,5 0,125 0,005 R= 0,9954
15,55
B 15’ 0,25 2,5 0,125 0,024
69,97
A= -0,0334
C 30’ 0,25 2,5 0,125 0,063
171,41 B= 5,5923
D 40’ 0,25 2,5 0,125 0,075 X= 0,05
189,49
0,21g Sin Lactato de A 0’ 0,25 2,5 0,125 0,006
sodio
20,43 Y= 0,2461
B 15’ 0,25 2,5 0,125 0,054
172,41 FRC= 0,1788 mg urea/ml
C 30’ 0,25 2,5 0,125 0,062
184,76
D 40’ 0,25 2,5 0,125 0,064
177,09
μg urea /g de tejido

Velocidad de produccion de urea en mg de tejido fresco por minuto

Producción de urea a través del tiempo
6
250

μg de urea/gramo de tejido fresco/min

200
4

150 3

2
100

1
50
0
Completo Sin Krebs Sin carbonato Sin ornitina Sin lactato
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Medios
Tiempo (minutos)

Completo Sin Solución de krebs Equipo: Metertech S.P 830 Plus.

Sin Carbonato de Amonio Sin Ornitina
N° de serie: 83004342.
Sin Lactato de Sodio
Fecha: 28/03/2017
Bibliografia
• Lehninger A, Nelson D, Cox M. Principios de bioquímica. 4th ed.
Barcelona: Omega; 2005.
• Burtis C, Ashwood E, Bruns D, Tietz N. Tietz fundamentals of clinical
chemistry. 6th ed. St.
• Paik W, Kim S. Determination of N-methylurea: Comparison of two
colorimetric methods using diacetyl monoxime or α-
isonitropropiophenone. Analytical Biochemistry [Internet]. 1982 [cited 24
April 2017];122(1):194-198. Available from:
http://linkinghub.com.scihub.cc/retrieve/pii/000326782902706
• Guzmán L, Orrego R, Wehinger S. Manual de laboratorio bioquímica
clínica I. 1st ed. Talca: Universidad de Talca, Facultad de ciencias de la
salud. Dpto. Bioquímica clínica e Inmunohematología; 2017.