TECNICAS ENZIMATICAS

Mamani Vilca Wilfredo

TECNICAS ENZIMATICAS

 La propiedad mas característica de una enzima es su poder para

catalizar una reacción química definida
 La presencia de una enzima se detecta por las reacciones que ellas
catalizan
 La cantidad de una enzima se estima a partir de la velocidad de
reacción
MEDICION DE LA VELOCIDAD

 Las curvas de progreso de las reacciones enzimáticas, muestran que la

velocidad decae con el tiempo (velocidad vs. tiempo)
 Las causas de esta caída son:
 A) Los productos de la reacción pueden inhibir a la enzima.
 B) El grado de saturación de la enzima por el S puede disminuir a
causa de la caída de la [S] conforme procede la reacción
 C) La reacción inversa puede hacerse mas importante a medida que
aumenta la [ ] de los productos.
 D) La enzima puede inactivarse por la temperatura o el pH de la
reacción
UNA TÌPICA CURVA DE PROGRESO
CURVA DE PROGRESO NO TIPICA

Hay que determinar la causa, para luego modificar

el procedimiento para eliminar esto de modo que se
pueda usar la velocidad en la forma normal
Ejemplo

 A) La D-aminoácido oxidasa requiere una coenzima flavínica que se

combina lentamente con la enzima; por lo tanto, la cantidad de enzima
activa aumenta tiempo, después de mezclar los reactivos, produciendo
una aceleración.

 Esto se puede
eliminar incubando
primero la enzima
con la coenzima y el
S se añade al final
para iniciar la
reacción.
 B) Una enzima en una solución stock concentrada puede estar en la
forma de un agregado parcialmente activo, que se disocia a la forma
totalmente activa durante la dilución de la mezcla de reacción.
 Esto se trata añadiendo primero la E y luego el S para iniciar la
reacción
 C) La enzima en la solución stock se halla formando un complejo revresible
con un ión metálico inhibidor (impureza) que se disocia por dilución.
 Este caso se trata igual que a y b
 Por lo tanto, no es fácil decidir si la velocidad inicial, la Vmax o la
pendiente de la curva en otro punto dan una medida exacta de la
actividad de la enzima
CLASES DE METODOS

 Para seguir las reacciones enzimáticas existen dos tipos de métodos:

 Métodos por muestreo: Las observaciones no se realizan en la misma
mezcla de reacción sino sobre muestras retiradas a varios tiempos
(puntos separados, curvas discontinuas)
 Métodos continuos: Las observaciones se hacen en la misma mezcla de
reacción. Muchas lecturas o por registro automático, curvas continuas.
ASPECTOS PRACTICOS:
Para obtener linearidad
 Se deben mantener constantes las condiciones de la mezcla de reacción
 La reacción debe ser realizada en un termostato
 Todos los reactivos deben ser llevados a la temperatura correcta antes
de iniciar la reacción
 Usar un buffer adecuado para evitar cambios en el pH
 Escoger condiciones de pH y temperatura adecuados apara la enzima
ASPECTOS PRÁCTICOS: Debido a la
alta actividad catalítica de las enzimas

 Evitar las trazas de enzimas en las puntas de pipetas o los polvos enzimáticos
(trazas de saliva: usar tapones de algodón en los topes de las pipetas cuando
se trabaje con amilasas)
ASPECTOS PRACTICOS: Para hacer
lecturas correctas
 Ajustar la velocidad de reacción por dilución adecuada de la enzima
 Mezcla rápida y completa
ASPECTOS PRACTICOS: Cómo
guardar las enzimas
 Las enzimas deben ser guardadas en soluciones stock altamente
concentradas:
A. Precipitación con sulfato de amonio
B. Concentración con cromatografía
C. Concentración con membranas diaflo (AMICON)

 Para iniciar la reacción: realizar mezcla rápida y completa por agitación

(manual o con vortex)
MANEJO GENERAL DE ENZIMAS

 Evitar inactivación
 Eliminar condiciones en las que la enzima es inestable: altas temperaturas,
soluciones ácidas o alcalinas (evitar pH <5 o >9), alcohol
 Durante la purificación usar cuarto frio, o baño refrigerado que contiene
alcohol diluido (usar vasos de acero)
 La mayoría de enzimas se inactivan a pH pH <5 o >9. Agregar ácido por las
paredes del vaso y con agitación
MANEJO GENERAL DE ENZIMAS

 Evitar formación de espuma, pues las enzimas se desnaturalizan en las

superficies: El vaciado de un vaso a otro se debe realizar por las paredes
(inclinando); hojas de agitador sumergidas profundamente y el vástago debe
girar a plomo
 Las sales: agregar poco a poco para evitar burbujas. Usar soluciones saturadas
de sal.
 Usar solventes fríos para el fraccionamiento (acetona, alcohol)
 Los detergentes pueden afectar a la enzima y son difíciles de eliminarlos
METODOS PARA SEGUIR
CUANTITATIVAMENTE LAS REACCIONES
ENZIMATICAS
 Métodos espectrofotométicos
 Métodos de fluorescencia
 Métodos manométricos
 Métodos de electrodo
 Métodos polarimétricos
 Métodos por muestreo
Espectrofotómetro Beckman
Beckman DU-650 UV-Vis spectrophotometer
with sipper and sampler
ESPECTROFOTÓMETRO DE
FLUORESCENCIA
RESONANCIA MAGNETICA NUCLEAR

 La resonancia magnética nuclear (RMN) es un fenómeno físico basado en las

propiedades mecánico-cuánticas de los núcleos atómicos. RMN también se
refiere a la familia de métodos científicos que exploran este fenómeno para
estudiar moléculas (espectroscopia de RMN), macromoléculas (RMN
biomolecular), así como tejidos y organismos completos
 La resonancia aprovecha que los núcleos atómicos (i. e. dentro de
una molécula) resuenen a una frecuencia directamente proporcional a la
fuerza de un campo magnético ejercido, de acuerdo con la ecuación de la
frecuencia de precesión de Larmor.
Electroforesis
 La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas según la movilidad de éstas
en un campo eléctrico.La separación puede realizarse sobre la superficie hidratada de un
soporte sólido (p. ej., electroforesis en papel o en acetato de celulosa), a través de una
matriz porosa (electroforesis en gel), o bien en disolución (electroforesis libre). Dependiendo
de la técnica que se use, la separación obedece en distinta medida a la carga eléctrica de las
moléculas y a su masa.
 La electroforesis se usa en una gran mayoría en la materia del ADN recombinante ya que nos
permite saber la carga que poseen los polipéptidos, y separar los diferentes polipeptidos
resultantes de las variaciones del experimento del ADN recombinante. La variante de uso más
común para el análisis de mezclas de proteínas o de ácidos nucleicos utiliza como soporte
un gel, habitualmente de agarosa o de poliacrilamida. Los ácidos nucleicos ya disponen de
una carga eléctrica negativa, que los dirigirá al polo positivo, mientras que las proteínas se
cargan al unirse con sustancias como el SDS (detergente) que incorpora cargas negativas de
una manera dependiente de la masa molecular de la proteína. Al poner la mezcla de
moléculas y aplicar un campo eléctrico, éstas se moverán y deberán ir pasando por la malla
del gel (una red tridimensional de fibras cruzadas), por lo que las pequeñas se moverán
mejor, más rápidamente. Así, las más pequeñas avanzarán más y las más grandes quedarán
cerca del lugar de partida
ANALISIS QUIMICO PROXIMAL
 Contenido en agua
 La mayoría de los alimentos contienen una proporción comprendida entre el
60 y el 95 %
 Puede estar como:
 a) libre se libera con facilidad
 b) ligada como agua de cristalización , unida a las proteínas a los azucares o
adsorbida sobre los coloides .
 Requiere un calentamiento de distinta intensidad y en algunos casos
permanece ligada incluso al carbonizar el alimento
 El % de agua en un alimento solo tendrá significado si se especifica el método
seguido para su determinación
 𝑝𝑒𝑟𝑑𝑖𝑑𝑎 𝑑𝑒 𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑔 ×100
 %𝐻𝑢𝑚𝑒𝑑𝑎𝑑 = 𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎
0,563×100
 %𝐻𝑢𝑚𝑒𝑑𝑎𝑑 = = 56,3%
1𝑔

 Donde:
peso de capsula vacía = 17,543g
peso de capsula + matriz antes de secado = 18,543g
peso de capsula + matriz después de secado = 18,106g
  Cenizas
 Las cenizas se obtienen al someter el alimento a un proceso de incineración,
mediante el cual se destruye la materia orgánica.
 Están constituidas por óxidos o sales (carbonatos, fosfatos, sulfatos, ect), de
los diferentes elementos.
 Dependiendo del tipo de alimento, así será el método de incineración mas
conveniente.
𝑚2 − 𝑚0
%𝑐𝑒𝑛𝑖𝑧𝑎𝑠 = × 100
𝑚1 − 𝑚0

17.604 − 17.543
%𝑐𝑒𝑛𝑖𝑧𝑎𝑠 = × 100
18.543 − 17.543

%𝑐𝑒𝑛𝑖𝑧𝑎𝑠 = 6,1%
 Grasa.
Una cantidad previamente homogeneizada y seca, medida o pesada del alimento
se somete a una extracción con éter de petróleo o éter etílico, libre de peróxidos
o mezcla de ambos. Posteriormente, se realiza la extracción total de la materia
grasa libre por soxhlet.
Peso papel filtro = 1,969
Muestra seca = 2,705
Total = 4,674g
Peso de la muestra + papel filtro luego de la extracción = 4,305g
4,674 − 4,305
%𝑔𝑟𝑎𝑠𝑎 = × 100
2,705
%𝑔𝑟𝑎𝑠𝑎 = 13,64
 El nitrógeno total o proteico (N x 6,25) se determina por el método de
Kjeldahl, que consiste en convertir todo el N orgánico (de las proteínas en su
mayoría ) en N amoniacal (como NH4SO4) , destilar el amoniaco (en medio
básico) y valorarlo con una disolución ácida contrastada. El % de proteína se
calcula multiplicado el % de N por el factor.
1,7 × 0,1 × 0.014 × 1
%𝑛𝑖𝑡𝑟𝑜𝑔𝑒𝑛𝑜 = × 100
0,4

%𝑛𝑖𝑡𝑟𝑜𝑔𝑒𝑛𝑜 = 0,595%

%𝐴𝑐𝑡 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 = 0,595 × 1,7

%𝐴𝑐𝑡 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 = 1,0115

 Fibra bruta
Está constituida por celulosa, lignina y pentosanas
Es un índice de las sustancias presentes en los alimentos vegetales.
El método para su determinación consiste en la digestión de la muestra vegetal
con H2SO4 y NaOH en condiciones especificas
𝑝𝑝𝑚 − 𝑝𝑝 − (𝑝𝑐𝑝𝑚 − 𝑝𝑐𝑝)
%𝑓𝑖𝑏𝑟𝑎 = × 100
𝑇𝑀(𝑔)
Ppm=peso seco papel filtro + muestra
Pp=peso de papel filtro
Pcpm=peso final (tras incineración): (crisol + papel filtro + muestra) seco.
Pc=peso crisol
TM=tamaño de muestra
2,103 − 0,707 − (31,058 − 30,105)
%𝑓𝑖𝑏𝑟𝑎 = × 100
1,009
%𝑓𝑖𝑏𝑟𝑎 = 43,9%