Universidade Federal de Alagoas

Faculdade de Nutrição
Mestrado em Nutrição

Métodos de análise e
padrões microbiológicos.
Jammily Moreira
 Por que analisar quais e quantos
microorganismos estão nos alimentos?

 Condições de higiene do preparo.

 Riscos à saúde do consumidor.

 Esse alimento terá vida útil pretendida?

 Verificar conformidade com os padrões.

 Por que analisar quais e quantos
microorganismos estão nos alimentos?
 Métodos de análise

Métodos “convencionais” X Métodos “rápidos”.

 Convencionais desenvolvidos há muitos anos, descritos em

publicações de referências e oficiais na maioria dos laboratórios .

 Rápidos Desenvolvidos a partir de 1970, simplificam o

trabalho e reduzem os custos, são mais sensíveis e específicos.
Amostragem
Amostragem
Amostragem
Amostragem
Amostragem
Amostragem
 Amostragem

 Obtenção correta das amostras

Representativa, íntegra e identificada.

 Transporte para o laboratório Análise em até 36 horas

e perecíveis e refrigerados mantidos entre 0° e 4,4°C
 Preparação da amostra para análise

 Mínimo de 200g /ml (25g, 50g ou 100g);

 Técnicas assépticas;
 Homogeneização com diluente apropriado.
 Preparação da amostra para análise

Vantagens do Stomacher:
 Não forma aerossóis;
 Não gera calor;
 Saco descartável (incubação)

Desvantagem:
 Sacos não resistentes;
 Meio ambiente.
 Métodos de contagem de
Microorganismos

 Métodos diretos:
Baseados na multiplicação bacteriana, visualização de
colônias em meios sólidos ou turvação de meio em meios
líquidos.
 Métodos indiretos:
Estima o número de microorganismos em parâmetros
diferentes da multiplicação.
 Métodos de contagem de
Microorganismos

Métodos diretos:

 Contagem por plaqueamento;

 Determinação do Número mais provável.
 Contagem por plaqueamento

Método convencional

 Plaquea-se alíquotas do alimento homogeneizado e

suas diluições em diferentes meios de cultura e
emprega-se diferentes condições (“Spar”).
Contagem por plaqueamento
Contagem por plaqueamento
 Contagem por plaqueamento

Pour plate Em superfície

 Contagem por plaqueamento

Plaqueamento em espiral:

 Sistema automatizado;
 Succiona a amostra;

 Faz a semeadura da amostra sobre uma placa giratória;

 Contagem manual ou automática à laser
 Conta de 1 a 1000 colônias em uma única placa!
 Contagem por plaqueamento

Técnica de membrana filtrante:

Contagem por plaqueamento
 Contagem por plaqueamento

Placas de Petrifilm:

 Método mais avançado;

 Cartões de papel revestidos de meio, corantes e
gelificastes desidratados;
 Prontas para uso;
 Inocular 1 ml da amostra diluída e incubar;
 Contagem feita visualmente na placa;
 Usada também no monitoramento de ambientes.
Contagem por plaqueamento

Placas de Petrifilm:
 Determinação do Número Mais
Provável
Técnica dos tubos múltiplos

 Muito utilizada para estimar quantidade de coliformes

totais, coliformes fecais, E. coli e S. aureus;
 Diluições decimais seriadas;
 Alíquotas transferidas para grupos de 3 ou 5 tubos,
com meio escolhido e tubo Durhan para coleta de gás;
 Incubados e positivos identificados.
 Determinação do Número Mais
Provável
Desvantagens

 Resultados imprecisos (estimativa);

 Uso de dois ou três meios diferentes;
 Análise longa (vários dias).
 Métodos de contagem de
Microorganismos

Métodos indiretos:

 Técnica de impedância;
 Técnicas de bioluminescência;
 Microcalorimetria;
 Radiometria.
 Técnica de impedância

 Baseia-se na propriedade que os microorganismos tem

de alterar a transmissão da corrente elétrica através de
um meio de cultura, muito utilizado para detectar
Salmonella, Listeria e E. coli.

Ex: Rabit, Malthus e Bactometer.

 Técnicas de bioluminescência

 Baseada no número de ATP (trifosfato de adenosina),

que está relacionado ao número de células
metabolicamente ativas.
 O ATP reage com o sistema luciferina-luciferase e emite
luz medida por luminômetro.
 Venda de kits.
Atenção !!!
Alimentos cárneos e leite tem ATP extra celular e precisam
ser hidrolisados com aspirase.
 Microcalorimetria

 Aparelhos muito sensíveis medem o calor gerado

pela multiplicação dos organismos;
 Técnica rápida, mas que ainda precisa de maiores
estudos na área de alimentos.
 Radiometria

 Técnica muito sensível que consiste em monitorar a

produção de CO2 radioativo após suplementação do caldo
com substrato radioativo (glicose, glutamato e etc.);
 A quantidade de CO2 radioativo liberado é proporcional ao
número de microorganismos presentes.

Atenção!!! As dificuldades de trabalho com isótopos

radioativos têm limitado sua utilização.
 Isolamento e identificação de
microorganismos patogênicos

 Semeadura em meio próprio para isolamento e

testes complementares (bioquímicos) para
identificação.
 Novos métodos:
• Técnicas bioquímicas miniaturizadas;
• Técnicas imunológicas;
•Técnicas genéticas.
Isolamento e identificação de
microorganismos patogênicos
Isolamento e identificação de
microorganismos patogênicos
 Técnicas bioquímicas miniaturizadas

kits comerciais que fazem as reações bioquímicas

de maneira rápida e eficiente, alguns com
interpretação baseada em combinação de números
ou com softwares que facilitam a identificação.
 Técnicas imunológicas

 Baseados em reação antígeno-anticorpo;

 Podem ser :
Imunocaptura, imunoenzimática e
imunoimobilização.
 Técnicas genéticas

Reação de Polimerase em Cadeia (PCR)

 Multiplica-se um único fragmento de DNA milhares de

vezes em poucas horas (exponencial);
 Usa-se a enzima DNA polimerase;
 O início da cópia se dá através de dois nucleotídeos
iniciadores (primers);
 Reação de Polimerase em Cadeia

Ciclo

 Desnaturação do DNA – separação em fita simples;

 Anelamento – Ligamento dos primers;
 Polimerização – formação de fita complementar
Reação de Polimerase em Cadeia
Visualização em gel de agarose
 Considerações na escolha do método

 Precisão;
 Custo;
 Tempo da análise;
 Recursos;
 Aceitabilidade do método pelos órgãos oficiais.

Atenção!!! Controle de qualidade laboratorial.

 RESOLUÇÃO-RDC Nº 12, DE 02 DE
JANEIRO DE 2001
 Visando a proteção à saúde da população

 Considerando a definição de critérios e padrões microbiológicos

para alimentos, indispensáveis para a avaliação das Boas Práticas
de Produção de Alimentos e Prestação de Serviços;

 Importância de compatibilizar a legislação nacional com

regulamentos harmonizados no Mercosul;
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JANEIRO DE 2001
ALCANCE
 OBJETIVO : Estabelecer os Padrões Microbiológicos Sanitários para
Alimentos e determinar os critérios para a Conclusão e
Interpretação dos Resultados das Análises Microbiológicas de
Alimentos.

 ÂMBITO DE APLICAÇÃO : Aplica aos alimentos destinados ao

consumo humano. Excluem-se os produtos alimentícios e as
toxinas de origem microbiana, definidos em legislação especifica.
Excluem-se também matérias-primas alimentares e os produtos
semi-elaborados.
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JANEIRO DE 2001
CRITÉRIOS PARA O ESTABELECIMENTO DE PADRÕES

 Caracterização dos microrganismos de interesse sanitário.

 Classificação dos alimentos segundo o risco epidemiológico.

 Métodos de análise que determinem os microrganismos .

 Plano de Amostragem.

 Normas e padrões de organismos internacionalmente reconhecidos,

Codex Alimentarius e outros organismos.
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JANEIRO DE 2001
 PROCEDIMENTOS E INSTRUÇÕES GERAIS

 As metodologias devem obedecer ao disposto pelo Codex

Alimentarius.
 Caso sejam utilizados outros métodos laboratoriais, ou
modificações, os mesmos devem ser validados por estudos
comparativos intra e inter laboratoriais que certifiquem os
resultados e sejam equivalentes aos das metodologias citadas.
 Colheita de amostra em suas embalagens originais não violadas e
quantidade mínima de 200g ou 200mL por unidade amostral.
 Amostras deterioradas ?
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 PROCEDIMENTOS E INSTRUÇÕES GERAIS

 A amostra deve ser enviada ao laboratório devidamente

identificada e em condições adequadas para análise e ser avaliada
quanto a possibilidade de ser utilizada.
 Amostra implicada em casos de DTA deve vir acompanhada de
relatório adicional com informações que permitam direcionar a
determinação analítica pertinente.
 Planos de amostragem ?
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 PROCEDIMENTOS E INSTRUÇÕES GERAIS

 Considerações sobre os grupos de microrganismos pesquisados :

 "coliformes a 45ºC" é equivalente à denominação de "coliformes de
origem fecal" e de "coliformes termotolerantes".
 Determinação de clostrídio sulfito redutor a 460C tem por objetivo
a indicação de Clostridium perfringens.
 A enumeração de estafilococos coagulase positiva tem por objetivo
substituir a determinação de Staphylococcus aureus.
 Resultados por contagem em placa devem ser expressos em UFC/ g
e indicar NMP/ g ou mL , quando forem obtidos por esta
metodologia.
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JANEIRO DE 2001

 PROCEDIMENTOS E INSTRUÇÕES GERAIS

 O resultado da determinação de Salmonella sp, Listeria
monocytogenes deve ser expresso como Presença ou Ausência na
alíquota analisada.
 Na elucidação de DTA, os resultados devem especificar o número
de células viáveis do microrganismo. Os valores padrões não se
aplicam para o diagnostico de caso/surto de DTA.
 Em situações de risco epidemiológico que justifique um ALERTA
SANITÁRIO, podem ser realizadas outras determinações não
incluídas nos padrões estabelecidos.
 Padrões Microbiológicos Sanitários
para Alimentos

 A tolerância é máxima e os padrões são mínimos para os diferentes

grupos de produtos alimentícios.

 No caso de análise de produtos não caracterizados nas tabelas,

considera-se a similaridade da natureza e do processamento do
produto, como base para seu enquadramento nos padrões
estabelecidos para um produto similar
RESOLUÇÃO-RDC Nº 12, DE 02 DE
JANEIRO DE 2001
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JANEIRO DE 2001
 CONCLUSÃO E INTERPRETAÇÃO DOS
RESULTADOS
 Interpretação dos resultados: Para interpretação dos resultados,
compara-se os valores encontrados nas análises realizadas com
os valores estabelecidos.
 Produtos em condições sanitárias satisfatórias são aqueles cujos
resultados analíticos estão abaixo ou igual aos estabelecidos .
 Produtos em condições sanitárias insatisfatórias:
 são aqueles cujos resultados analíticos estão acima dos limites
estabelecidos para amostra indicativa ou amostra representativa
ou demonstram a presença ou a quantificação de outros
microrganismos patogênicos ou toxinas que representem risco à
saúde do consumidor.
 Laudos
 "PRODUTO OU LOTE DE ACORDO COM OS PADRÕES LEGAIS
VIGENTES" para as situações...

 2.2."PRODUTO OU LOTE IMPRÓPRIO PARA O CONSUMO HUMANO

POR APRESENTAR ..." (citar o(s) resultado(s) analítico(s) e o(s)
parâmetro(s) não atendido(s) para as situações ...

 2.3."PRODUTO OU LOTE IMPRÓPRIO PARA O CONSUMO HUMANO

POR APRESENTAR ....(microrganismo patogênico ou toxina que
representa perigo severo a saúde do consumidor).
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Faculdade de Nutrição
Mestrado em Nutrição

Padrões microbiológicos e
métodos de análise.
Jammily Moreira