Analisis

Analisis Kualitatif
Analisis kualitatif dari asam nukleat digunakan untuk mengetahui
susunan genetik. Dalam analisis kualitatif, hal yang diuji meliputi
bagaimana karakteristik yang dihasilkan dari sampel uji (DNA maupun
RNA).
Beberapa analisis kualitatif Asam Nukleat terdiri dari Elektroforesis,
Blotting, RFLP, Spektroskopi X-Ray Difraction (XRD), Hibridisasi,
Pewarnaan, Pengurutan/Sequencing, serta Mikroskop Elektron
Elektroforesis
Elektroforesis bertujuan untuk mengetahui secara kualitatif panjang
pendek nya suatu asam nukleat.
Elektroforesis gel ialah metode untuk memisahkan molekul asam
nukleat dengan memanfaatkan sifat DNA yang bermuatan negatif (pada
gugus fosfat). Dengan adanya muatan negatif molekul akan bergerak
menuju kutub positif dari gel. Umunya metode ini untuk tujuan analisis
tapi juga bisa sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul
sebelum digunakan dalam metode-metode lain misalnya spektrometri
massa, PCR, kloning, sekuensing DNA, immuno blotting, dll.
Asam nukleat yang akan dianalisis dimasukkan ke dalam gel yang akan
berperan sebagai matrix untuk menampung dan memisahkan molekul-
molekul target. Gel tersebut dicelupkan dalam peralatan elektroforesis
beserta larutan penyangga yang memiliki arus listrik. Larutan
penyangga dibutuhkan untuk meminimalisir perubahan PH akibat
adanya medan listrik dan juga mencegah gel menjadi terlalu panas
akibat adanya arus listrik.
Sampel DNA (asam nukleat) bergerak menuju elektroda positif.
Kecepatan migrasi molekul-molekul tersebut bergantung pada berat
molekul asam nukleat. Semakin panjang rantai suatu molekul (beratnya
lebih berat) maka migrasi semakin lambat dan begitu sebaliknya. Oleh
karena itu, molekul asam nukleat dapat dibedakan berdasarkan berat
molekulnya dengan cara membandingkan dengan sampel standar
(berat molekul diketahui). Asam nukleat juga dapat dibedakan
berdasarkan pasangan nukleotidanya karena berat moelkul asam
nukleat berbanding lurus dengan panjang rantai sehingga semakin
banyak pasangan nukelotida semakin panjang rantainya.
Untuk mempermudah proses analisis dibutuhkan pewarna agar asam
nukleat yang tidak berwarna tersebut dapat terlihat jelas
Gambar 1. Ilustrasi
Elektroforesis Gel
Blotting
Merupakan teknik untuk memindahkan bagian protein yang telah
dipisahkan, baik RNA atau DNA dari gel ke lembaran tipis atau matriks
membran. RNA blotting disebut Northern Blotting sedangkan DNA
disebut Southern Blotting. Keduanya bertujuan untuk menganalisis
urutan RNA maupun DNA.
Blotting merupakan lanjutan dari elektroforesis gel.
Prinsip perpindahan DNA atau RNA ke membran adalah menggunakan
daya kapilaritas. Membran yang digunakan pada proses blot southern
adalah membran nitroselulosa, sedangkan pada proses blot northern
yang digunakan adalah kertas DBM.
Langkah-langkah keduanya adalah serupa.
Langkah-langkah:

• Denaturasi DNA menggunakan enzim restriksi endonuclease

• Memisahkan menggunakan elektroforesis
• Menempatkan DNA pada lembaran kertas filter dan dibenamkan
dalam larutan buffer.
• Meletakkan membran nitroselulosa di atas gel, serta beberapa kertas
kering di atas membran.
• Larutan buffer bergerak melewati gel dan tertarik kertas filter.
• DNA yang terbawa buffer akan berikatan dengan membran.
• Membran nitroselulosa dipanaskan dengan suhu tinggi kemudian
membran diberi radiasi UV agar terbentuk ikatan ikatan kovalen dan
permanen antara pita-pita DNA dengan membran.
• Membran dicampur dengan probe (pelacak) yang telah
dilabel radioaktif.
• Probe diinkubasi dengan membran agar dapat berhibridisasi dengan
DNA yang ada pada membran.
• Probe yang tidak terikat dicuci dari membran sehingga yang tinggal
hanya probe yang hibrid dengan DNA di membran.
• Melakukan autoradiografi untuk visualisasi pola hibridisasi.
Gambar 2. Ilustrasi Northern Blot
RFLP (Restriction Fragment Length
Polymorphism )
RFLP bertujuan untuk mendeteksi variasi pada tingkat sekuen DNA.
Deteksi RFLP dilakukan berdasar pada adanya kemungkinan untuk
membandingkan profil pita-pita yang dihasilkan setelah dilakukan
pemotongan dengan enzim restriksi terhadap DNA target/dari individu
yang berbeda. Berbagai mutasi yang terjadi pada suatu organisma
mempengaruhi molekul DNA dengan berbagai cara, menghasilkan
fragmen-fragmen dengan panjang yang berbeda. Perbedaan panjang
fragmen ini dapat dilihat setelah dilakukan elektroforesis pada gel,
hibridisasi dan visualisasi.
Aplikasi teknik RFLP biasa digunakan untuk mendeteksi diversitas
genetik, hubungan kekerabatan, sejarah domestikasi, asal dan evolusi
suatu spesies, genetic drift dan seleksi, pemetaan keseluruhan genom,
tagging gen, mengisolasi gen-gen yang berguna dari spesies liar,
mengkonstruksi perpustakaan DNA.
Spektroskopi Xray Difraction
Teknik ini digunakan untuk mengidentifikasi fasa kristalin dalam
material dengan cara menentukan parameter struktur kisi serta untuk
mendapatkan ukuran partikel. Metode ini didasarkan pada kenyataan
bahwa kisi dimensi molekul (yaitu, kristal) menghasilkan difraksi sinar-x
dan difraksi sinar-x pada setiap material akan berbeda satu dengan
yang lainnya.
DNA merupakan molekul berukuran besar yang tidak mengalami
krisatilisasi. Sehingga agar bisa dianalisis dengan spektroskopi XRD,
DNA diekstrak terlebih dulu dalam bentuk garam natrium (untuk
menetralkan muatan negatif dari fosfatnya) untuk menghasilkan
suspensi serat molekulnya yang memiliki viskosistas tinggi. Serat-serat
tersebut membentuk pola difraksi secara jelas.
Photo 51 (Sinar-X yang menunjukkan DNA sebagai heliks)
Hibridisasi
Metode hibridisasi asam nukleat dapat digunakan untuk mendeteksi
keberadaan DNA serta untuk mengetahui letak gen spesifik dalam sel.
Hibridisasi DNA merupakan metode atau teknik yang memanfaatkan
kemampuan asam nukleat untuk membentuk molekul dengan dua
rantai yang stabil ketika dua rantai tunggal dengan basa yang
komplementer digabungkan dalam kondisi yang sesuai.
Langkah – langkah:
• Melakukan denaturasi DNA dengan
suhu tinggi atau perubahan pH
ekstrem.
• Mengidentifikasi DNA atau RNA
tersebut menggunakan elektoforesis
kemudian memisahkannya pada
membran.
• Menambahkan probe kepada
membran yang berisi DNA atau RNA
target.
Gambar 4. Hibridisasi
Pewarnaan / Stainning
Staining atau pewarnaan ialah proses untuk mengidentifikasi adanya
RNA atau DNA dengan memberikan pewarna (dye). Metode ini
digunakan sebagai visualisasi DNA setelah separasi pada gel
elektroforesis. Pengamatan dengan staining berguna untuk
• Mengetahui letak nukleus
• Mengetahui siklus sel dengan menganalisa letak DNA
• Mengetahui sel adalah sel hidup dengan adanya DNA
Terdapat beberapa jenis pewarnaan, yakni:
• Ethium Bromida
• Acridine Orange
• SYBR Gold
• SYBR Green
• SYBR Safe
• EVA green
Pengurutan / Sequencing
Metode ini untuk mengetahui urutan basa nukleotida, yakni adenin,
guanin, citosin, dan timin pada DNA yang relatif pendek sehingga dapat
diketahui kode genetik dari molekul DNA. DNA yang akan diidentifikasi
urutan basanya dijadikan cetakan lalu diamplifikasi dengan enzim atau
bahan-bahan kimia dengan penambahan beberapa reaksi tertentu.
Terdapat dua metode pengurutan, yakni Metode Maxam-Gilbert dan
Metode Sanger.
Metode Maxam-Gilbert merupakan metode pembelahan DNA pada
lokasi tertentu menggunakan zat-zat kimia. Tahapannya adalah

1. Salah satu ujung DNA ditandai dengan fosfat radioakif.

2. Molekul DNA dipotong-potong secara parsial dengan piperidin. Pengaturan
massa inkubasi atau konsentrasi piperidin akan menghasilkan fragmen-fragmen
DNA dengan bebagai ukuran.
3. Basa dimodifikasi dengan bahan kimia tertentu
• Dimetilsulfat (DMS) akan memetilasi basa G
• Asam fosfat menyerang basa A dan D
• Hidrazin menghidrolisis C dan T. Namun, kadar garam tinggi akan menghalangi
reaksi T sehingga hanya bekerja pada C
• Pada akhirnya akan dihasilkan empat macam fragmen, yakni ujung G, ujung A
atau G, ujung C atau T, dan ujung C
Pada Metode Sanger, Terjadi sintesis atau pemotongan DNA secara
enzimatik melalui pembentukan ikatan fosfodiester gugus 5’ fosfat yang
bebas dari nukleotid yang masuk dan gugus 3’ OH dari rantai yang
tumbuh. Proses ini berlangsung di sepanjang DNA. Metode ini
menggunakan dideoxynucleotide triphosphates (ddNTPs) dan dNTP.
Sekuensi DNA dengan dideoksi dilakukan pada empat reaksi yang
terpisah yang masing-masing berisi dNTP sehingga polimerisasi DNA
dapat berlangsung. Lalu masing-masing ditambahkan sedikit ddNTP
sehingga polimerisasi akan terhenti pada tempat tertentu sesuai ddNTP
yang ditambahkan.
Pada ddNTPs terdapat atom H pada karbon-3 dari gula ribosa yang
akan menghentikan pertumbuhan rantai akibat 3’ OH yang dibutuhkan
untuk pertumbuhan berikutnya tidak ada. Jadi, di dalam tiap reaksi
akan dihasilkan sejumlah fragmen DNA yang ukurannya bervariasi
tetapi ujung 3’ nya selalu berakhir dengan basa yang sama.
Mikroskop Elektron
Mikroskop Elektron adalah alat yang mengontrol pencahaayaan saat
pengamatan dan tampilan gambar. Kemampuan pembesaran objek dan
resolusi yang lebih baik dari mikroskop cahaya sehingga lebih akurat.
Mikroskop ini dapat memberpesar objek hingga dua juta kali.
Mikroskop elektron dapat digunakan untuk melihat struktur untaian
ganda DNA dan melihat interaksi protein, RNA, dan biomolekul lainnya
dengan DNA. Hasil yang didapatkan merupakan gambaran langsung
dari DNA
Langkah – langkah analisis menggunakan
mikroskop electron:
• DNA dirobek untaian ganda nya dari larutan
encer
• DNA diletakkan pada papan silicon
nanoscopic. Papan silikon ini dibuat untuk
anti air sehingga larutan akan mudah
menguap dan hanya tersisa untaian DNA.
• Pancaran elektron dari mikroskop mengenai
untaian DNA dari lubang nano pada dasar
papan untuk memperoleh gambar resolusi
tinggi
• Struktur DNA untai ganda dapat
teridentifikasi dengan jelas

Gambar 5. Hasil DNA pada Mikroskop Elektron.

 Analisis Kuantitatif
Analisis kuantitatif pada asam nukleat merupakan analisis yang
didasarkan pada perolehan data yang bersifat statistik dan angka (lebih
bersifat numeris).
Beberapa analisis kualitatif Asam Nukleat terdiri dari RT-PCR,
Microarray, Spektroskopi UV-Vis, dan SAGE.
Real Time PCR
PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan reaksi berantai dengan
memanfaatkan aktivitas enzim polymerase. Teknik ini digunakan untuk
replikasi (memperbanyak) DNA secara enzimatik tanpa menggunakan
organisme sehingga menghasilkan DNA dalam jumlah besar dengan
waktu yang singkat. Jumlah sampel yang dibutuhkan hanya sedikit.

Real Time PCR (disebut juga quantitative real time polymerase

chainreaction/qPCR) adalah suatu teknik pengerjaan PCR di
laboratorium untuk mengamplifikasi (memperbanyak) sekaligus
menghitung (kuantifikasi) jumlah target molekul DNA hasil amplifikasi
tersebut.
 Tahapan pada PCR:
• Denaturasi
Pada proses ini double stranded DNA akan
berubah menjadi single starnded.
• Annealing (penempelan primer)
Primer merupakan DNA berukuran pendek
yang mempunyai panjang sekitar 10 sampai
30 pasang basa. Pada annealing primer akan
menempel pada untai DNA target yang telah
dipisahkan sebelumnya pada proses
denaturasi.
• Extension (pemanjangan)
Setelah primer menempel pada DNA target,
enzim DNA polymerase akan
memanjangkan sekaligus membentuk DNA
Gambar 6. Tahapan PCR. yang baru dari gabungan antar primer, DNA
cetakan, dan nukleotida.
Analisa menggunakan Real Time PCR memungkinkan untuk dilakukan
pengamatan pada saat reaksi berlangsung, keberadaan DNA hasil
amplifikasi dapat diamati pada grafik yang muncul sebagai hasil
akumulasi fluoresensi dari probe (penanda). Pada Real Time PCR
pengamatan hasil tidak lagi membutuhkan tahap elektroforesis,
sehingga tidak lagi dibutuhkan gel agarose dan penggunaan Ethidium
Bromide (EtBr) yang merupakan senyawa karsinogenik.
Cara kerja Real Time PCR mengikuti prinsip umum reaksi PCR, yang
utama adalah DNA yang telah diamplifikasi dihitung setelah
diakumulasikan dalam reaksi secara real time sesudah setiap siklus
amplifikasi selesai.
Microarray
Microarray merupakan salah satu metode analisis yang bersifat
kuantitatif dengan tujuan untuk menganalisis DNA dari sel-sel orang
yang berpenyakit . Prinsip dasar analisis dari microarray adalah dengan
cara menghibridisasi DNA sampel pada chip DNA (dikenal sebagai
microarray). Micoarray merupakan chip yang berukuran kecil yang
terbuat dari lempengan kaca yang berisi ribuan bahkan puluhan ribu
macam gen dalam bentuk fragmen DNA yang berasal dari penggandaan
cDNA. Fragmen DNA yang memuat gen tersebut dapat mengenali gen
dalam suatu sampel jaringan yang dianalisis. Pola ekspresi suatu gen
dalam jaringan yang berbeda pun juga dapat diamati dengan
menggunakan teknik ini.
Prinsip kerja dari microarray adalah mengukur jumlah hibridisasi mRNA
pada cDNA dalam chip tersebut. Pada umumnya analisis dengan
menggunakan microarray menggunakan dua sampel yang berbeda,
misalnya sel kulit normal dengan sel kanker kulit. Kedua sampel
tersebut diisolasi mRNA-nya dan kemudian diletakkan dalam chip
microarray. Kemudian chip tersebut diberi penanda radioaktif untuk
menghasilkan warna fluorosens setelah dilakukan scanner yang
terhubung dengan komputer. Kemudian komputer akan menganalisis
kedua sampel tersebut berdasarkan pola warna yang ada.
Spektroskopi UV-Vis
Uji kuantitatif DNA dengan spektrofotometri UV-Vis sebenarnya memanfaatkan
kemampuan DNA murni yang dapat menyerap cahaya ultraviolet karena
keberadaan basa-basa purin dan pirimidin. Pita ganda DNA dapat menyerap cahaya
UV pada lamda 𝜆 = 260 nm, sedang kontaminan protein atau phenol akan
menyerap cahaya pada 𝜆 = 280 nm. Sehingga kemurnian DNA dapat dukur dengan
menghitung nilai absorbansi 𝜆 = 260 nm dibagi dengan nilai absorbansi 𝜆 = 280
(Å260/Å280).
DNA memiliki nilai tingkat kemurnian yang tinggi jika nilai absorbannya antara 1.8
sampai 2.0, jika melebihi nilai 2.0 maka larutan yang diuji masih mengandung
kontaminan dari protein membran atau senyawa lainnya sehingga kadar DNA
plasmid yang didapat belum murni
Selain menentukan kemurniannya, kita juga dapat menentukan konsentrasi
DNA atau RNA dalam suatu sampel. Rumus yang dapat digunakan untuk
menghitung konsentrasi dari DNA atau RNA tersebut adalah sebagai berikut :

[DNA] = Å260 x 50 x faktor pengenceran

Å260 = nilai absorbansi pada 𝜆 = 260 nm

50 = larutan dengan nilai absorbansi 1.0 sebanding dengan 50 μg untai ganda
DNA

[RNA] = Å260 x 40 x faktor pengenceran

40 = 40 μg untai ganda RNA per ml

SAGE (Serial Analysis of Gene Expression )
SAGE merupakan salah satu metode analisis yang bersifat kuantitatif
untuk mengekspresikan kode genetik dari mRNA secara digital. Dalam
metode ini, ditujukan untuk mengamati bagaimana gen dari sebuah sel
atau jaringan diekspresikan dalam bentuk kode-kode genetik. Kode-
kode genetik yang tercatat kemudian akan disimpan dalam bentuk
database secara digital untuk dapat dianalisis.
Tahapan metode SAGE:
• Mengekstrak mRNA dari sampel.
• mRNA yang sudah terekstraksi akan dipotong-potong menjadi potongan
kecil secara acak menggunakan enzim restriksi.
• Potongan-potongan pendek tersebut dirangkai menjadi satu rantai panjang
yang mengandung basa nukleat yang sudah diberi tanda.
• Rantai panjang yang dihasilkan kemudian diubah menjadi bentuk vektor
agar dapat dibaca oleh komputer.
• Melakukan sequencing dan memproses datanya dengan komputer. Data
yang dihasilkan akan berisikan rantai-rantai DNA yang mempunyai variasi
yang beragam.