INSTITUTO TECNOLÓGICO DE TEPIC

Departamento de ingeniería Química y

Bioquímica

BIOLOGÍA MOLECULAR

“Mutagénesis de los genes SAV2511 y SAV2513 en Streptomyces

avermitilis: efectos
en la morfología y producción de avermectina y oligomicina”
Presenta:

Baltazar Bogarín Giovana Michel 15400051

Bravo López Aylin Michelle 15400054
García Bramasco César Armando 15400063
López Alba Laura Esther 15400075
Suárez Santiago Isela Alejandra 15400107
Torres Ramos María Isabel 15400108

Docente: Dra. Martina Alejandra Chacón López

INTRODUCCIÓN
Streptomyces es un género de bacterias que habitan en una
gran variedad de ambientes marinos y terrestres(Kieser et
al. 2000).
Su diferenciación morfológica involucra la formación de un
micelio y esporas, proceso semejante a los hongos (Talbot
1999; Elliot et al. 2004).
Su diferenciación morfológica involucra la formación de un
micelio y esporas, proceso semejante a los hongos (Talbot 1999;
Elliot et al. 2004). Esta característica es única entre las
bacterias Gram positivas, requiriendo un metabolismo
especializado y coordinado

• antiparasitarios,
• antitumorales
• Antifúngicos
• Antivirales
• Antihipertensivos
• antibióticos e
• inmunosupresores
Se ha reportado que ambos procesos (diferenciación-metabolismo
secundario) se encuentran relacionados, en ello se ve involucrada la
expresión de genes, los cuales son generalmente activados en la fase
estacionaria. La expresión de estos genes está controlada por una
compleja cascada de mecanismos regulatorios, lo que determinará el o
los metabolitos que se sintetizarán.
Generalmente estos genes están localizados en clusters, grupo de dos o
más genes que están sometidos a una regulación específica, lo que hace
que un determinado metabolito se sintetice en un momento concreto
durante el metabolismo secundario. Sin embargo, existen otros genes
fuera del cluster y que igualmente están involucrados en la
diferenciación y metabolismo secundario, cuyos productos tienen un
papel importante en la vida del hombre.
Entre otras investigaciones, el desarrollo de este conocimiento ha
permitido proponer dos mecanismos regulatorios en especies de
Streptomyces:
a) cascada piramidal de regulación, la cual involucra una vía asociada a
proteínas reguladoras y
b) reguladores globales relacionados a señales de estrés
EN RESUMEN

El presente trabajo se enfoca en este segundo sistema de regulación,

concretamente en el papel que tienen los genes SAV2511 y SAV2513
en la producción del antiparasitario avermectina y el antitumoral
oligomicina, empleando la técnica de mutagénesis por transposones.
En este trabajo, se investigan genes que codifican proteínas
implicadas en la regulación de la respuesta hacia el estrés osmótico
en Streptomyces avermitilis, bacteria productora de avermectina.

La interrupción de SAV2511 que codifica a una proteína

de la regulación de la respuesta y SAV2513 el cual codifica a un
multidominio regulador del factor alternativo sigma (SigB),
conduce al incremento en la producción tanto de avermectina como
de oligomicina por encima del 37% y el 200% respectivamente. De
igual manera, la mutación afecta el desarrollo morfológico bajo
condiciones de estrés osmótico, y las mutantes son incapaces de
formar micelio aéreo.
ANTECEDENTES

Desde la secuenciación del genoma de Streptomyces coelicolor a la fecha, se

han venido realizando avances sobre la comprensión del metabolismo en
actinomicetos. Diferentes especies de actinomicetos poseen los genomas más
grandes entre los procariotas, posiblemente reflejando su capacidad para
adaptarse a las variantes condiciones de su medio ambiente; en consecuencia
poseen una capacidad importante de regulación.
OBJETIVO GENERAL

Evaluar si los genes SAV2511 y SAV2513 están involucrados tanto

en la diferenciación como en la producción de avermectinas y
oligomicina en S. avermitilis
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Montar el método de cuantificación de avermectinas y oligomicina
por bioensayo y HPLC.
• Evaluar el método de biobalística, como alternativa en la
introducción de DNA a la célula.
• Determinar el efecto de la interrupción de los genes SAV2511 y
SAV2513 sobre la
• diferenciación en condiciones de estrés osmótico y sin estrés
osmótico
• Determinar si la interrupción de los genes SAV2511 y SAV2513
similares a osaB y osaC,
• incrementan la producción de avermectinas y oligomicina
• Comparar la producción de avermectinas y oligomicina en cepas
mutadas y silvestres
• Proponer un mecanismo global de regulación involucrando los genes
SAV2511 y SAV2513
METODOLOGIA
Se aislaron los genes SAV2511 y SAV2513 del genoma de S. avermitilis y
el cosmido CL-236-G10 respectivamente mediante amplificación por
PCR ocupando los oligos con la siguiente secuencia:

Posteriormente se verificaron por medio de una electroforesis en gel de

agarosa y se seleccionaron los
productos amplificados correspondientes a SAV2513 y SAV2511
 Clonación de SAV2513 en pME6

Se realizo dirigiendo el producto de amplificación de SAV2513 y pME6

con las enzimas EcoRI y
XbaI, posteriormente se ligaron y se electroporó en células
electrocompetente de E. coli JM109
Se digirió con esta enzima y se insertó en el
sitio el transposón Tn5062 (ApramicinaR), obteniéndose un nuevo
vector de nombre pMCTn2.
se purificó y se obtuvo el vector de nombre pMCSa1, con la
característica de
tener dentro del gen un sitio único para la enzima EcoRV
Clonación de SAV2511 en pME6

se realizó, a partir del cósmido CL-236-G10, mediante la digestión con

las enzimas EcoRI y BglII; simultáneamente se digirió con las mismas
enzimas pME6, se ligaron y se electroporaron en células
electrocompetentes de E. coli JM109
se purificó y se obtuvo un nuevo vector de nombre pMBSa1, el
cual se digirió con la enzima KpnI, con el propósito de acortar eltamaño
del vector. Por otra parte se digirió pME6 con KpnI, se ligaron, se
electroporó y se purificó, obteniéndose el nuevo vector de nombre
pMBSa2L,
con la característica de tener en el gen el sitio de corte AatII; se digirió con esta
enzima, se realizó una digestión con la enzima T4 DNA polimerasa (para dejar
extremos romos) y se insertó el transposón Tn5062 (ApramicinaR). De esta
manera se obtuvo el nuevo vector pMBTn2, producto de la inserción del
transposon en el sitio AatII.
TRANSFORMACION DE E.coli
Se descongeló una alícuota de células electrocompetentes JM109 (40
µl) en un baño de hielo y agua y se mezcló con 3 µl de cada respectivo
vector. La mezcla se transfirió a una celda de electroporación –
previamente enfriada- se dio un choque eléctrico en un electroporador
Eppendorf
BIOBALISTICA
La inserción del gen mutante al cultivo de S.
avermitilis se llevo a cabo mediante la técnica de
biobalistica con la utilización de microcarriers de
tungsteno
RESULTADOS
La cepa silvestre de S. avermitilis generó colonias con fenotipo de interés
(apramicina-resistentes)
Determinación de la interrupción del
gene SAV2511 Y SAV2513
Para comprobar la presencia del gen interrumpido, se realizó un PCR de cada
una de las colonias, lo cual confirma la presencia del gen interrumpido
(SAV2511 y de SAV2513).
Cuantificación de oligomicina y
avermecitina a partir de productos de
fermentación por HPLC.
A partir de los productos de fermentación en condiciones sin estrés
osmótico, la producción de avermectina incrementó tanto en SAV2511
como SAV2513, esto con respecto a la cepa silvestre.
 CONCLUSIONES
El presente trabajo demostró que:

• El método de biobalística empleado en el presente trabajo demostró ser un

método efectivo en la introducción de DNA en Streptomyces avermitilis.
• La interrupción de genes por transposones en Streptomyces es una efectiva
técnica.
• La interrupción en la función de los genes SAV2511 y SAV2513, tiene como
consecuencias cambios en la morfología cuando crecen en condiciones de estrés
osmótico (incapacidad para formar micelio aéreo).
• Su interrupción tiene por consecuencia el incremento en la producción de
avermectina y oligomicina.
• La complementación cruzada del gen SAV2511 restaura su fenotipo; para el gen
SAV2513, no hay restauración del fenotipo
• El gen SAV2513 funciona como antagonista de factor σB regulando la respuesta al
estrés osmótico.
 Perspectivas
• La interrupción de los genes SAV2511 y SAV2513 puede ser usada como
parte de un programa de mejoramiento genético para incrementar la
producción de avermectinas y oligomicina.

• La función de los genes SAVB y SAVC, puede ser extrapolada hacia

otros actinomicetos de importancia industrial.

• La complementación homóloga proporcionaría información adicional

sobre la función de ambos genes
 Bibliografía
Acuña-Arguelles, M.E., Gutierrez-Rojas, M., Viniegra-Gonzalez, G., and
Favela-Torres, E. (1995). Production and properties of three pectinolytic
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Arena, J. P., Liu, K. K., Paress, P. S y Cully, D. F. (1991). Avermectin-sensitive

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