Tesis de Grado I

Estudio de la producción de
azucares fermentables a partir de la
celulosa contenida en desechos
agrícolas o industriales, a partir de
una hidrólisis enzimática.

Tutor Académico: Elaborado por:

Prof Rafael Martín Belmonte Daniela Narciso
 Tesis de Grado I

Planteamiento
del Problema
Introducción
 Tesis de Grado I

Antecedentes
 Antecedentes

• Charles Wilke y Gautam Mitra (1974), patentaron el

proceso para la conversión de materiales celulósicos por
medio de una degradación enzimática.

• Folke Tjerneld e Ingrid Persson (2004), estudiaron las

particiones de la Trichoderma reesei con el objeto de
diseñar un sistema de fases.

• Okazaki y Moon-Young (2005) desarrollaron un modelo

matemático de la cinética de la reacción enzimática,
basándose en el modelo de Michaelis-Menten.
 Tesis de Grado I

Objetivos
 Objetivo General

Estudiar el proceso de hidrólisis

enzimática del bagazo de caña o
residuos agrícolas de composición
similar para la producción de azúcares
fermentables.
 Objetivos Específicos

• Determinar las ventajas de la realización de un

pretratamiento del sustrato antes de la realización
del proceso de hidrólisis.

• Comparar el comportamiento de los diferentes

sustratos en la producción de los azúcares
fermentables.
 Objetivos Específicos

• Determinar las condiciones de operación óptimas para

cada uno de los sustratos en lo que se refiere a la
concentración de enzimas, concentración de sustrato y
tamaño de partícula de sustrato.

• Determinar las características principales del reactor

que llevará a cabo dicho proceso a escala industrial.

• Establecer las diferencias básicas entre la hidrólisis

ácida y la hidrólisis enzimática.
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Marco
Teórico
 Biomasa

Se denomina biomasa al grupo de productos

energéticos y materias primas de tipo renovable que
se originan a partir de la materia orgánica formada
por vía biológica.
Fuentes de Biomasa
Valor Energético de la Biomasa
 Características de la Biomasa

• Amigable con el medio ambiente ya que su balance de

emisiones de CO2 es cero.

• Es una fuente de energía renovable.

• Permite reactivar la economía de zonas rurales y de países

sin hidrocarburos.

• Generación de gran cantidad de empleos.

• Aprovechamiento de recursos que antes eran en su mayoría

desechados.

• Está conformada por Lignina, Hemicelulosa y Celulosa.

 Lignina

Es un polímero tridimensional que se forma a partir de

las unidades fenilpropánicas que se han desarrollado, de
manera aleatoria, formando una molécula grande y
compleja con muchas clases diferentes de ligamentos
entre los bloques estructurales.

Por ser un compuesto de difícil degradación, representa

el principal obstáculo del proceso de hidrólisis.
Lignina
 Hemicelulosa

La hemicelulosa es un polímero de cadena más corta y

ramificada cuyos monómeros pueden ser de cinco
átomos de carbono, o de seis átomos de carbono. Son
de naturaleza amorfa y sirven, con la lignina, para formar
la matriz en la cual se incrustan las fibrillas de celulosa.
 Celulosa

La celulosa es un polisacárido lineal formado por

residuos de glucosa unidos por enlaces b 1-4.

Éstas cadenas lineales de celulosa interaccionan entre si

por medio de enlaces de puentes de hidrógeno dando
lugar a la formación de microfibrillas.
 Bagazo de Caña

El bagazo es el residuo del tallo o cuerpo de la caña de

azúcar que queda después de que se le ha extraído el
jugo, ya sea en el ingenio o en el trapiche.

Entre los usos del bagazo tenemos:

• Producción de biocombustibles.

• Abono.

• Combustible en el ingenio.

• Otros.
 Composición del Bagazo de Caña

Componentes (%)
Humedad 50
Fibra 46
Brix 2
Impurezas Minerales 2

Componentes (%)
Celulosa 50
Hemicelulosa 25
Lignina 25
 Ventajas del Uso del Bagazo de Caña

• Elevada eficiencia fotosintética, es decir, puede

sintetizar carbohidratos solubles a una tasa superior al
de otros cultivos comerciales.

• Es un cultivo permanente.

• La duración de la cepa es de 5 cosechas.

• La energía invertida en la producción de caña

representa, a lo sumo, el 5% de su potencial.
 Enzimas

Las enzimas, también conocidas como biocatalizadores,

son aquellos compuestos proteínicos que actúan como
catalizadores de numerosas reacciones biológicas.

Estas no modifican el sentido de los equilibrios

químicos, sino que aumentan la velocidad de la
reacción.
 Características de las Enzimas

• Son efectivas en pequeñas cantidades.

• No sufren modificaciones químicas irreversibles

durante la catálisis.

• Pueden catalizar procesos a bajas temperaturas

• No afectan la condición de equilibrio de la reacción

que catalizan.
 Clasificación de las Enzimas

Grupo Acción
Oxidoreductasas Catalizan reacciones de oxidorreducción.

Transferasas Transfieren grupos activos (obtenidos de la ruptura

de ciertas moléculas) a otras sustancias receptoras.
Hidrolasas Actúan en reacciones de hidrólisis con la
consiguiente obtención de monómeros a partir de
polímeros.
Isomerasas Actúan sobre determinadas moléculas obteniendo de
ellas sus isómeros de función o de posición.
Liasas Realizan la degradación o síntesis de los enlaces
denominados fuertes sin ir acoplados a sustancias de
alto valor energético.
Ligasas Realizan la degradación o síntesis de los enlaces
fuertes mediante el acoplamiento a sustancias ricas
en energía como los nucleosidos del ATP.
 Cinética Enzimática

La cinética enzimática estudia la velocidad de las

reacciones catalizadas por enzimas. Estos estudios
proporcionan información directa acerca del mecanismo
de la reacción catalítica y de la especificidad de la
enzima.

En 1913, Leonor Michaelis y Maud Menten desarrollaron

la teoría de la cinética enzimática y propusieron una
ecuación de velocidad que explica el comportamiento
cinético de las enzimas.
 Ecuación de Michaelis-Menten

Michaelis y Menten propusieron que las reacciones

catalizadas enzimáticamente ocurren en dos etapas.
 Celulasa

Son biocatalizadores de naturaleza proteica, que

participan en el rompimiento de los enlaces glicosídicos
b-1,4 presentes en los polisacáridos celulosa, liberando
al medio glucosa y otros monosacáridos.

endo-b-glucanasas exo-b-glucanasas

b-glucosidasa
Mecanismo de Acción de la Celulasa
Microorganismos Productores de Celulasa

Microorganismo Tipo de Respiración

Bacterias
Cellulomonas Aeróbico
Pseudomonas Fluorescens Aeróbico
Clostridium Anaeróbico
Thermocellulaseum
Hongos
Aspergillus Níger Aeróbico
Fusarium Solani Aeróbico
Trichoderma Reesei Aeróbico
Trichoderma Viride Aeróbico
Aspergillus Niger
 Pretratamientos

Los pretratamientos son requeridos para alterar la

estructura de la biomasa para hacerla mas accesible a
las enzimas que convertirán a las cadenas poliméricas
en azúcares fermentables.

La meta es romper el sello que forma la lignina y la

hemicelulosa e irrumpir en la estructura cristalina de la
celulosa.
 Pretratamientos
Lignina
Celulosa

Pretratamiento

Hemicelulosa
 Objetivos de los Pretratamientos

• Reducir la cristalinidad de la celulosa.

• Disociar el complejo lignina-celulosa.

• Aumentar el área superficial de la fibra de celulosa.

• Disminuir la presencia de aquellas sustancias que

dificulten el proceso de hidrólisis.
 Características de los Pretratamientos

• Deben ser muy eficaces.

• Bajos costos de inversión y mantenimiento.

• Bajo consumo energético.

• Utilización de reactivos económicos.

• Posible aplicación a diversos sustratos.

Tipos de Pretratamientos

Pretratamiento Químico
Ozonólisis
Hidrólisis con Ácido Diluido
Hidrólisis con Ácido Concentrado
Hidrólisis Alcalina
Deslignificación Oxidativa
Organosolventes
Tipos de Pretratamientos

Pretratamiento Físico
Pulverizado Mecánico
Pirólisis
Pretratamiento Físico-Químico
Explosión con Vapor
Agua Líquida Caliente (LHWP)
Explosión de fibra con Amoníaco
Pretratamiento Biológico
Pretratamiento con Hongos
 Hidrólisis

La hidrólisis de residuos lignocelulósicos tienen como

finalidad la transformación de los polisacáridos que estos
contienen en azúcares sencillos, fermentables a su vez a
distintos productos de interés industrial.

La hidrólisis se puede llevar a cabo tanto por vía química

como por vía biológica.
 Hidrólisis Química

Este proceso utiliza ácidos como H2SO4, HCL y HF a

diferentes concentraciones, altas temperaturas y en
diversos procesos operativos.
 Hidrólisis Enzimática

La hidrólisis enzimática de la celulosa consiste en la

utilización de enzimas celulolíticas, producidas por
algunos hongos y bacterias, para obtener una solución
de glucosa a partir de dicho sustrato que es
originalmente insoluble.
Ventajas y Desventajas de la Hidrólisis Enzimática

Ventajas Desventajas
Opera a condiciones suaves de La lentitud del proceso debido a
temperatura (30 – 50 °C) la propia estructura de los
sustratos celulósicos nativos.
La no utilización de agentes
químicos, ya que así se evita la
corrosión de los equipos y la
degradación de los azúcares
producidos.
Alta especificidad. La necesidad de recuperación de
las enzimas del medio de
reacción.
 Tesis de Grado I

Metodología
Laboratorio
 Materiales

Complejo Enzimático Bagazo de Caña

(Celulasa)
 Reactivos

Solución Ácido Solución de Glucosa

Amortiguadora Dinitrosalicílico de 40 mMol
Acetato
Equipos

Baño
Termostatizado
 Equipos

Molino con tamiz

pH metro
incorporado
 Equipos

Plancha de Calentamiento y Agitación Magnética

Espectrofotómetro
 Equipos

Balanza Analítica Balanza Galénica

 Método DNS

El seguimiento de la hidrólisis se realizará por medio de

la determinación del contenido de azucares fermentables
solubles por medio del método del ácido dinitrosalicílico.

El acido dinitrosalicílico se reduce formando el acido

3-amino-5-nitrosalicílico, mientras que el grupo aldehído
reductor se oxida para formar un grupo carboxílico, lo
cual causa diferencias de coloración que pueden
determinarse por espectrofotometría, a una longitud de
onda de 570 nm.
 Método DNS
• Se toma 0.4 ml de la solución azucarada y se coloca en
un tubo de ensayo.

• Añadir 4 ml de la solución de DNS agitando para

homogenizar.

• Calentar la muestra en un baño de agua a ebullición

durante 10 minutos.

• Enfriar la solución a la temperatura ambiente en un

baño de agua fría.

• Medir la absorbancia en un espectrofotómetro a 570

nm.
Método DNS
 Curva de Calibración de Glucosa

• Preparar soluciones con concentraciones conocidas de

glucosa.

• Aplicar el método del DNS.

• Enfriar las muestras a la temperatura ambiente.

• Calibrar el espectrofotómetro a cero con el blanco.

• Determinar la absorbancia a 570 nm.

• Construir la curva de calibración de glucosa graficando a la

absorbancia obtenida en función de la concentración de
glucosa.
 Acondicionamiento de la Materia Prima

• Colocar al bagazo de caña en una estufa a 76 °C

durante 24 h.

• Moler el bagazo de Caña.

• Pasar el bagazo molido a través de tamices.

• Clasificar el bagazo según su tamaño de partícula.

• Almacenar el bagazo en frascos de vidrio dentro de

bolsas de plástico herméticas a temperatura
ambiente.
 Pretratamiento LHWP

La porción de bagazo de caña a ser pretratado se

coloca en una olla de presión con 2 litros de agua por 1
hora a 2 atm de presión.
 Hidrólisis Enzimática

Valores Óptimos de las Variables de Operación

Temperatura (°C) 37
pH 5,0
 Hidrólisis Enzimática

• Preparar soluciones de celulasa en buffer acetato a

pH = 5 y a las diferentes concentraciones de estudio.

• Pesar la masa de sustrato y sumergirlo en la solución

de celulasa en buffer. La proporción dependerá de la
relación líquido – sólido que se pretende estudiar.

• Incubar la solución en un baño termostatizado a 37 °C

con agitación suave.

• Aplicar el método del DNS a la solución en ciertos

intervalos de tiempo.
 Estrategia de Análisis

Concentración
Masa de
Sustrato
de enzima 1,5 g/l 3 g/l 6 g/l

0,25 g

0,5 g

2g
 Estrategia de Análisis

Adicionalmente, se realizara pruebas para:

• Diferentes tamaños de partícula.

• Bagazo sin pretratamiento.

• Otros sustratos.
 Hidrólisis Química

• En un erlenmeyer colocar la muestra de bagazo de

caña en contacto con una solución de H2SO4 al 4% y
a una relación liquido/sólido de 30/1.

• Colocar el recipiente en un baño termostatizado y

fijar la temperatura de reacción en 100 °C.

• Agitar la mezcla de reacción con un agitador

magnético.
 Hidrólisis Química

• Cada cierto tiempo se toman muestras de la solución

y se le aplica un enfriamiento brusco y se filtra a
través de papel de filtro whatman No 1 para detener
la hidrólisis.

• Añadir a la solución NaOH 2 M hasta lograr un pH de

4,5.

• Aplicar el método del DNS.

Resumen de la Metodología
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PREGUNTAS
 Tesis de Grado I

GRACIAS