Aislamiento y Bioaumento de una Bacteria Degradante de

Estradiol y su integración en un biofilm maduro.

Castañeda Veronica
Cevallos Andres
Delgado Gabriela
Loayza Kelly
Yunga Cristian
INTRODUCCIÓN AL
PROBLEMA
• Los estrógenos se libran de los anticonceptivos o la terapia
hormonal sustitutiva, además de anabolizantes, sedantes,
antidepresivos, analgésicos, antibióticos los cuales se
introducen al medio ambiente a través de descargas de agua
residual municipal, efluentes de plantas de tratamiento o
por escurrimientos con desechos de la ganadería y otras
actividades pecuarias.
Los estrógenos son los responsables en muchos casos
de la aparición de fenómenos de feminización,
hermafroditismo, y disminución de la fertilidad de
muchas especies acuáticas.
• La contaminación con el 17 estradiol (E2), el cual
causa efectos endocrinos, es potencialmente
dañino para la biótica acuática y la salud publica
• La eliminación de este tipo de contaminantes puede
ser mejorada con la introducción de cepas de
microorganismos degradadores en un sitio
contaminado a la cual se le denomina tecnología
verde.
• La eficacia se mide según las supervivencia de la
bacteria y la velocidad de degradación del
contaminante.
• La bioaumentacion es exitosa en la degradación de
hidrocarburos , fenol, entre otros, se usa en
variedades de ambientes
• La bacteria EDB- LI1
degrada el E1 y E2
bioacumulandolo,
pero esto ocurrió en
condiciones de
laboratorio.
OBJETIVO GENERAL
Y ESPECÍFICOS
Objetivo general
• Aislar la Bacteria Degradante de Estradiol y su
integración en un biofilm maduro.
Objetivos específicos
• Aislar la bacteria estradiol- degradante de la película
del biofilm desarrollada sobre la matriz de
humedales.
• Evaluar la capacidad de bioaumentacion del estradiol
de la bacteria EDB- LI1 por medio de HPLC.
• Integrar la bacteria EDB- LI1 en un biofilm maduro en
dos humedales.
METODOLOGÍA DE
LA INVESTIGACIÓN
REALIZADA
Área de estudio y aislamiento bacteriano

-Las muestras se las tomo de un CW,

destinado a pulir las aguas residuales
después de tratamiento de lodos activados.
-2 humedales verticales: 30m2. Tanque 1
(tratamiento temprano).Tanque 2
(tratamiento avanzado)
-Enriquecimiento de EDB: 1.5g/litro
(NH4)2SO4, 0.3g/litro NaCl, 0.3g/litro
K2HPO4, 0.05g/litro MgSO4 7H2O, 50g/litro
fuente de C (17ᵝ-estradiol).
Bioaumentación de biofilms de humedales con EDB-LI1
-Caldo Luria (LB). Diluido a 1/100 y a 1/500 con EDB-
LI1 y con muestras de grava de basalto con biopefilm
del estanque 1 y estanque 2 se incuba por 4h a 30°C
en tubos estériles. Tubos son drenados y la grava se
lava con solución salina estéril y se incuba por 20h a
30°C (biofilm aumente o desarrolle).
-Al final de la incubación se recogen 0,5g de grava
con biofilm de cada tubo para la extracción de ADN y
se examinó 1g de grava con biofilm desarrollado
para la eliminación de E2.
Determinación de la concentración de estrógenos por HPLC

-Se incuba a 30°C con 1ml E2

(50mg/litro).
-E2 se extrajo adicionando 1ml de
acetonitrilo y se incubó por 2h a 30°C
con agitación (90%)
-El extracto fue filtrado (0.45um).
-El protocolo de HPLC: 60% de
acetonitrilo y 40% agua doble destilada,
velocidad de flujo 0,5ml/min en una
columna C18).
Extracción de ADN y análisis de composición de la
comunidad microbiana por DGGE

-Se extrajo el ADN (grava), sirve para la

amplificación de fragmentos por PCR
del gen 16S rRNA bacteriano utilizando
los cebadores Eub341F y Univ907R y
se analizó mediante DGGE.

-Bandas del gen 16S rRNA en el gel

fueron digitalizados y analizados
utilizando el software Fingerprinting II
Informatix y neighbor-joining tree
based on UPGMA.
Clonación y secuenciación de 16S rRNA
-Colonias aisladas de EDB en E2 se
resuspendieron directamente en la
mezcla de PCR para amplificación
del fragmento del gen 16S rRNA.
-Los productos de PCR fueron
secuenciados por Macrogen Inc.
-Las secuencias recuperadas:
analizaron mediante la herramienta
de búsqueda de alineación BLAST y
enviado a la base de datos GenBank.
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
RESULTADOS
• Aislamiento de la EDB: La mutua influencia entre este aislamiento y la bio film, que se
originó a partir de charcas del humedal, se investigó en términos de supervivencia EDB,
composición de la comunidad bacteriana, y la actividad de eliminación E2.

• Algunas de las bandas del cultivo de enriquecimiento inicial desaparecieron, mientras

que las nuevas bandas dominantes aparecieron con las transferencias posteriores.

• Bandas más dominantes fueron detectados en el cultivo enriquecido que contiene E2

que en el cultivo de control y sin E2.
Composición de la
comunidad bacteriana del
cultivo de enriquecimiento a
través de cinco
transferencias consecutivas
en presencia o ausencia de
estradiol como la única
fuente de carbono. Análisis
DGGE de 16S
• Por lo tanto, la composición de la comunidad bacteriana de los
cultivos de enriquecimiento se vio afectada por la presencia de E2
como única fuente de carbono.
• Las tres bandas de DGGE más dominantes de la quinta transferencia
contiene E2, fueron clonados y secuenciado.
• Estas bandas, que representan diferentes especies en el cultivo de
enriquecimiento, tenían similitudes de 97, 98, y 99% para cultivos.
Bacteroidetes, Novosphingobium sp. cepa JEM-1, y Hydrogenophaga
intermedia, respectivamente.
Aislamientos más cercanos determinados por
comparación de secuencias de ARNr 16S a Datos
de GenBank.
La degradación de E2 por
cultivo puro de EDB-LI1: La
eliminación de las tasas difieren
de la siguiente manera:
eliminación completa de 80
mg/litro E2 por la biofilm EDB-
LI1 requirió 3 días, mientras que
la eliminación de la misma
cantidad de E2 por cultivo de
plancton requiere 6 días.
Como resultado, el
número total de copias del
gen ARNr EDB-LI1 16S,
representando las células
EDB-LI1, fue mayor
durante las primeras 48 h
en el biofilm que en la
cultura planctónica, según
lo determinado por qPCR.
Bioaumentación de EDB-LI1 en biofilms de CW maduras: El aumento de EDB-LI1 no tuvo signifi-
no puede tener efecto sobre las composiciones bacterianas de las biofilms originarias del
estanque 1. Sin embargo, el aumento de EDB-LI1 en biofilms proveniente del estanque 2 causó
la división de los patrones DGGE en dos subgrupos: biofilm aumentado y no aumentado
DGGE es conocido por
identificar solo dominante
ribotipos en comunidades
mixtas. Dado que la banda
representa EDB-LI1 no se
encontró en el patrón DGGE de
cualquiera de los tratamientos,
se supone que su abundancia
relativa era baja.
DISCUSION
• La cepa bacteriana degradadora de E2 (EDB-LI1) fue capaz de
metabolizar y eliminar E2 (17 beta - estradiol ) y E1 se aisló de la
biopelícula CW.
• (Yu et al. 2007) aislaron 14 EDB filogenéticamente diversos a
partir de lodo activado de una planta de tratamiento de aguas
residuales perteneciente a tres phyla, Proteobacteria,
Actinobacteria y Bacteroidetes diferentes
• En el estudio actual, los ocho aislamientos filogenéticamente diversos
que se originaron del cultivo de enriquecimiento fueron capaces de
transformar E2 en E1, pero solo uno de ellos fue capaz de eliminar E1.
• E1 parece ser un disruptor endocrino (alteración equilibrio hormonal,
interrupción de procesos fisiológicos) importante en ambientes
acuáticos (D’Ascenzo, G., et al. 2003)
• (Hashimoto, 2010) la bacteria Novosphingobium sp. cepa JEM-1 aislado de una
planta de lodo activado convencional, se demostró que es capaz de degradar E1
y E2
• (Ke, J., et al. 2007) CYH, miembro de la familia Sphingomonadaceae, aislada de
un acuífero arenoso artificial en Singapur
• (Balkwill, 2006) miembros de la familia Sphingomonadaceae degradan una
variedad de otros contaminantes
• Estas bacterias de similitud filogenetica se aislaron de diferentes regiones
geograficas y exhiben la capacidad de degradar los estrogenos