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BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA

INSTITUTO DE CIENCIAS
CENTRO DE AGROECOLOGÍA
MAESTRÍA EN MANEJO SOSTENIBLE DE AGROECOSISTEMAS

Evaluación de mortalidad de Sphenarium purpurascens con


bio-preparados de Beauveria bassiana y diatomita en el cultivo de maíz.

PRESENTA
BIOL. LUIS JOSUÉ AMARO LEAL

COMITÉ TUTORAL
DIRECTOR DE TESIS
DR. JOSÉ FILOMENO CONRADO PARAGUIRRE LEZAMA
CO-DIRECTOR DR. OMAR ROMERO ARENAS

ASESORES
DR. JOSÉ ANTONIO RIVERA TAPIA
DR. PRIMO SANCHES MORALES

REVISOR DE TESIS
DR. JESÚS LOPÉZ OLGUÍN

Puebla, Pue., Diciembre 2017


INTRODUCCIÓN

Fuente: Amaro et al. 2017


Fuente: Amaro et al. 2017

En México, se ha convertido en
Los chapulines (Orthoptera: una plaga que provoca pérdidas
Acrididae; Romaleidae) son económicas entre el 20 y 30% de
organismos cosmopolitas, la producción, principalmente en
distribuidos en zonas tropicales, los cultivos de maíz, frijol y
desérticas o árticas, sin embargo, las pastizales, siendo el estado de
altas poblaciones se desarrollan en Puebla uno de los más afectados
las praderas (Bland y Jaques, 2010; (Fontana et al., 2008; Bustillos-
Bustillos-Rodriguez et al., 2015). Rodríguez et al., 2015).
En México, es el
El maíz es el cereal grano de mayor
que más se cultiva en importancia que se
el mundo, la destina para
producción en 2014 consumo humano y
fue de 982 millones se calcula que en
de toneladas métricas promedio se
Fuente: Amaro et al. Fuente: Amaro et al.
(tm) a nivel mundial 2017 consumen 343 g por 2017
(USDA, 2014; IGC, día per cápita
2015). (CEDRSSA, 2014).

El daño se realiza
cuando los
chapulines se
alimentan de los
estigmas de los
elotes en formación,
evitando el llenado Fuente: Amaro et al.
del grano (Fontana et 2017
al., 2008; Tamayo-
Mejía, 2009).
Fuente: Amaro et al. 2017 Fuente: Amaro et al. 2017 Fuente: Amaro et al. 2017

10 chapulines/m2 por
S. purpurascens en hectárea, consumen
estado de ninfa y adulto Llegando a consumir 25 kg, cantidad que
causa severos daños al casi la mitad de su equivale al consumo
cultivo de maíz, peso corporal de que realiza una vaca
principalmente en el forraje verde en un en un día (García et
valle de Puebla- día, lo que equivale a al., 2006; Cerritos y
Tlaxcala (Cerritos y 250 mm diarios. Cano-Santana, 2007;
Cano-Santana, 2007). Chaírez et al., 2008;
Huerta et al, 2014).
• Los métodos más comunes para su control se basan en
el uso de insecticidas químicos como paratión,
Hemingway et malatión y carbaryl, que ocasionan daños al ambiente y
al., 2002; Li et generan resistencia en las poblaciones.
al., 2007.

• En México, el empleo de plaguicidas se ha


incrementado anualmente en un 10%, por lo que es
necesario modificar estas prácticas agrícolas para
Ávila, 2004. reducir el riesgo en la salud de los productores y de los
consumidores.

• El control biológico se presente como una alternativa


para el combate en el manejo de S. purpurascens;
Badii y Abreu, siendo este un método de control de plagas más
2006. racional y respetuoso con el medio ambiente.
El uso de organismos benéficos como una alternativa sostenible de
control de insectos, es recomendable dentro de un manejo integrado de
plagas, ya que no tiene efectos nocivos para el medio ambiente, la
salud del hombre y los animales.
• Jiménez, 1998.

Los hongos han sido una de las mejores alternativas para el control de
plagas en los últimos años; asimismo, presentan un amplio espectro de
huéspedes.

• De Faria y Wraight, 2007.

Entre los hongos más utilizados como insecticidas biológicos se


incluye a Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae, donde
Beauveria bassiana infecta más de 200 especies de insectos y ácaros
de diversos géneros.
• Rodríguez y Arredondo, 2007; Polar et al., 2008.
Para la utilización de B. bassiana, como agente de control
biológico, es necesario desarrollar formulaciones que garanticen
su viabilidad, capacidad de desarrollo y almacenamiento.

• Rodríguez y Arredondo, 2007

Se eligió como preservador de conidios a la tierra de


diatomeas, que está constituida de dióxido de silicio de restos
fosilizados de algas diatomeas de agua dulce y salada.

• Cook y Armitagge, 2000

El silicio constituye cerca del 70 al 90% en la tierra de diatomea,


así como calcio, fosforo, azufre, níquel, zinc, manganeso,
aluminio, hierro, magnesio, sodio y cal, compuestos importantes
para el desarrollo de microorganismos.
• Korunic, 1998; Fields y Korunic, 2000
JUSTIFICACIÓN
En los últimos años se han realizado numerosos estudios alrededor del
mundo respecto a la patogenicidad de Beauveria sp. sobre diferentes
plagas. Malekan et al. (2013) evaluó el efecto de B. bassiana sobre
mosca blanca (Trialeurodes vaporarium) en Irán, por su parte Sun et al.
(2013) evaluó la efectividad de B. bassiana en la garrapata
Rhipicephalus microplus en China, Castillo y Sword (2015), sobre
gusano elotero Helicoverpa zea en E.U.A.

En México también se han realizado estudios respecto a la patogenicidad


de Beauveria sp.; sin embargo en el estado de Puebla pocos han
estudiado el efecto de Beauveria sp., sobre el chapulín.
OBJETIVO GENERAL
• Evaluar el efecto de la combinación de 6 biopreparados integrados por
2 compuestos inertes como soporte (tierra de diatomita y zeolita) y un
compuesto orgánico como preservante “Beauveria bassiana” como
estrategia para el manejo agroecológico de Sphenarium purpurascens.

OBJETIVO PARTICULARES

• Identificar a nivel molecular la cepa Cp-BA1 de Beauveria sp.

• Evaluar el grado de patogenicidad de los bioprepardos elaborados con


el hongo Beauveria sp.

• Determinar el grado de incidencia de S. purpurascens sobre el cultivo


de maíz en una zona de Amozoc de Mota, Puebla, afectado por
Beauveria Sp. así como de otros entomopatogenos.
HIPÓTESIS
La secuencia obtenida para cada región genómica de la cepa Cp-
BA1 de Beauveria sp., tendrá un 90% de homología con la
especie B. bassiana existente en la base de datos públicos
BLAST, presente en el sitio web del National Center of
Biotechnology Information (NCBI) de los Estados Unidos.

El biopreparado que incluya Beauveria sp., diatomita y zeolita,


presentará un mayor efecto entomopatogeno.

El cultivo de maíz inoculado con Beauveria sp. disminuirá la


densidad poblacional de S. Purpurascens en un 65%.
MATERIAL Y MÉTODOS
Material biológico
Fuente: Amaro et al. 2017
• La CP-MABb1 proviene del
Municipio de Tetela de
Ocampo, Puebla-México.

• Se construyó la filogenia,
considerando el modelo de
sustitución nucleotídica de
Kimura 2-p y Maximum
Paternity para inferir filogenias
Figura 1. Proceso de mediante el método de unión de
purificación del hongo Beauveria vecinos (White et al., 1990;
sp. Tamura et al., 2004).
Identificación de Beauveria sp.

PCR ITS Kit de


ExtracciónA
Purificación
DN ITS-1
ADN de
genómico ITS-4 Wizard®.

Secuenciaci
Kit ZR Electrofore ón
Fungal/Bact sis Datos
erial DNA horizontal públicos
MiniPrep (BIO-RAD) BLAST
Preparación de biopreparados y
viabilidad
Fuente: Amaro et al. 2017

• Se agregaron 500 mL de agua


destilada estéril, frotando
suavemente el arroz, para
reproducir masivamente en 300
g de arroz esterilizado.

• La concentración de conidios en
una proporción de 1/10 mediante
el conteo en una cámara
Neubauer, ajustando la
Figura 2. Preparación del medio suspensión inicial con 1x108
solido a partir de arroz. con/mL
Tabla 1. Formulación de biopreparados a base de conidios de B. bassiana.

Tierra de Diatomea Conidios de B. bassiana


Zeolita Agua
(TD) 1x108 con/mL
Clave
(g) (g) (mL) (g/mL)
Z+D+Bb1 25 25 10 240
Z+D 30 30 - 240
Z+ Bb1 50 - 10 240
D+Bb1 - 50 10 240
Bb1 - - 10 240
Testigo - - - 240

Se prepararon 6 formulaciones (tabla 1), utilizando 2 compuestos inertes


como soporte (tierra de diatomita y zeolita) y un compuesto orgánico
como preservante “Beauveria bassiana”.
Viabilidad de
conidios Fuente: Amaro et al. 2017

Se colocaron cinco
puntos con una
suspensión de 1x108
con/mL en cajas de Petri
(100 x 15 mm) con
PDA.
Se observaron 100
conidios y se registró el
número de conidios
germinados de los cinco
puntos Marín y Bustillo Figura 3. Diluciones para la efectuar la
(2002). prueba de viabilidad.
Inoculación de B. bassiana en
Sphenarium purpurascens, in
vitro.
Fuente: Amaro et al. 2017
• Se utilizaron tres diferentes estadios
de Sphenarium purpurascens
(segundo instar, cuarto instar y
adulto).

• Se colocaron 30 individuos de
diferentes estadios en una caja de
plástico de capacidad 102 L.

• Se agregó 250 mL de cada uno de


los bio-preparados del
entomopatógeno,

Figura 4. Aplicación de los


bioprepardos sobre S. • Se realizó cada 24 horas durante 10
purpurascens. días (Douglas et al. 1997).
Determinación de la mortalidad
La mortalidad corregida fue calculada mediante la fórmula de
ABBOTT1:
MC=[(%MT-%Mt)/(100-%Mt)]*100

Donde:
MC = Mortalidad corregida
MT = Mortalidad en el tratamiento
Mt = Mortalidad del testigo

Así mismo, se obtuvo la determinación del Tiempo Letal medio y alto


(TL50 y TL80) utilizando el modelo estadístico Probit (Finney, 1972) y
posteriormente se determinó la velocidad especifica de muerte K(d-1).
RESULTADOS
IDENTIFICACIÓN
Fuente: Amaro et al. 2017

• La cepa CP-Bb1 presentó un


crecimiento lento de forma
radial, llegando alcanzar 23
mm de diámetro en 10 días. B.
bassiana, presenta un rango de
0.6 a 2.3 cm de diámetro
Domsch et al. (1993).

• El tamaño de las células


conidiógenas es de 3.6 x 1.5
μm, el raquis de 2.2 x 1 μm. Figura 5. Identificación morfológica
Alean (2003) y Domsch et al. de B. bassiana
(1993).
Amplificación y
Secuenciación PCR-ITS
Figura 5. Carril 1: marcador de peso molecular 1 kb (Promega, EE.UU.),
Carril 2 al 4: amplificación del espaciador interno del transcrito (ITS) del
ADN ribosomal, con la combinación de los cebadores ITS1 e ITS4 (talla
aproximada de la banda: 520 a 610 pb) de la CP-MABb1 x triplicado,
Carril 5 al 7: amplificación del espaciador interno del transcrito (ITS) del
ADN ribosomal, con la combinación de los cebadores ITS1 e ITS4 de la
cepa comercial B-BLAS x triplicado, Carril 8: control negativo
Figura 6. Árbol filogenético de la CP-MABb1 generado por el método
Maximum Paternity, con longitud de 1216. Presenta un índice de
consistencia de 0.753289 (0.603699%), un índice de retención de
0.096386 (0.096386%) y un índice compuesto de 0.072606 (0.058188%).
El análisis involucró 10 secuencias de nucleótidos de la de la base de
datos del (NCBI) de la región 18S ribosomal de B. bassiana.
Figura 7. Árbol filogenético de la CP-MABb1 generado por el método
Neighbor-Joining, con la suma de la longitud de la rama de 75.07335039.
Las distancias evolutivas se calcularon utilizando el método de máxima
verosimilitud compuesta con 10 secuencias de nucleótidos de la de la
base de datos del (NCBI) de la región 18S ribosomal de B. bassiana.
Preparación de suspensiones y viabilidad de conidios
Tabla 3. Resultados con los diferentes tratamiento en cuanto
concentración y viabilidad.
Conidios %
Clave Concentración
x108/mL * Viabilidad *
1/1 10.30 ± 0.06 a 93.66 ± 0.33 a
Z+D+Bb1 1/5 9.57 ± 0.12 a 88.67 ± 0.33 b
1/10 9.57 ± 0.12 a 87.00 ± 0.57 bc
1/1 8.57 ± 0.20 b 85.00 ± 0.57 c
D+ Bb1 1/5 7.70 ± 0.06 b 83.67 ± 0.33 c
1/10 7.70 ± 0.06 b 81.00 ± 0.57 c
1/1 5.97 ± 0.15 c 69.00 ± 0.57 d
Z+Bb1 1/5 5.73 ± 0.12 c 59.00 ± 0.57 e
1/10 5.53 ± 0.12 c 54.33 ± 0.88 e
1/1 3.67 ± 0.15 d 53.00 ± 0.57 e
Bb1
1/5 3.37 ± 0.12 c 47.00 ± 0.57 f
(Control)
1/10 2.78 ± 0.12 c 34.00 ± 0.57 g
* Medias con letras diferentes en la columna indican diferencias
significativas con la prueba de Tukey-Kramer (α=0.05).
Evaluación de Mortalidad de
Sphenarium purpurascens in
vitro
Figura 8. Mortalidad de S. purpurascens de segundo instar a los 4 días
después de tratados con distintos biopreparados de B. bassiana a
diferentes concentraciones de conidios/mL.
Figura 9. Mortalidad de S. purpurascens del cuarto instar a los 4 días
después de tratados con distintos biopreparados de B. bassiana a
diferentes concentraciones de conidios/mL.
Figura 10. Mortalidad de adultos de S. purpurascens a los 4 días después
de tratados con distintos biopreparados de B. bassiana a diferentes
concentraciones de conidios/mL.
Tabla 4. Velocidad especifica de muerte K(d-1) y porcentaje de
mortalidad de los diferentes estadios larvarios de S. purpurascens en
diferentes bio-preparados a base de la CP-Bb1 de B. bassiana.
Bio- Instar 2 Instar 4 Adulto
preparados K(d-1) %M K(d-1) %M K(d-1) %M
0.76±0.7 96.66±08 0.92±0.0 93.33±0. 1.01±0.3 91.11±0.
Z+D+Bb1
6 5 4 19 0 11
0.88±0.8 83.33±0. 0.88±0.0 83.33±0. 1.01±0.1 85.55±0.
D+Bb1
9 93 4 19 4 11
0.88±0.8 73.33±0. 0.88±0.0 63.33±0. 1.17±0.5 82.22±0.
Z+ Bb1
9 93 2 09 9 11
0.94±0.6 65.55±0. 1.54±0.0 41.76±0. 1.13±0.0 74.56±0.
Bb1
0 22 4 58 8 31
1.13±0.1 23.44±0. 1.01±0.0 3.33±0.0 1.15±0.4 3.35±0.0
Z+D
4 29 3 1 1 2
(Control) 0 0 0 0 0 0
Figura 11. Análisis de componentes principales entre los diferentes
estados del chapulín (2 y 4 instar, adulto) con distintos bio-preparados
de B. bassiana a diferentes concentraciones de conidios/mL.
CONCLUSIONES
• Se obtuvo una ampliación de 521 pares de bases de las regiones
conservadas ITS1 e ITS4 de la cepa CP-MABb1, cuya secuencia
permitió identificar la homología del 99% para Beauveria bassiana
mediante el programa Mega 7, utilizando Maximum Paternity y
Neighbor-Joining, donde se involucró 10 secuencias de nucleótidos de
la base de datos del NCBI de la región 18S ribosomal para B. bassiana.

• La mayor concentración de conidios se presentó en el bio-preparado


(Z+D+Bb1 [1/1]) con 10.30x108 con/mL con una viabilidad del 94%.
• Los bio-preparados mostraron una tendencia lineal respecto a la
mortalidad de ninfas del 2º, 4o estadio, así como a los adultos de S.
Purpurascens in vitro, la cual fue directamente proporcional a la
concentración de conidios/mL de B. bassiana.

• La mayor velocidad especifica de muerte K(d-1) = 0.76± 0.76 la


presento el bio-preparado (Z+D+Bb1 [1/1]) a las 72 h post-infección,
en comparación al preparado (Z+D) que fue el resultado más bajo
obtenido en la presente investigación.

• Estos resultados demuestran la factibilidad del uso de B. bassiana en


combinación de la tierra de diatomita (TD) y zeolita para el control
biológico de S. Purpurascens para el cultivo de maíz.
2016-2018

Febrero-Marzo

Febrero-Marzo
Abril-Mayo

Abril-Mayo
Septiembre

Septiembre
Diciembre-

Diciembre-
Noviembre

Noviembre
Junio-Julio

Junio-Julio
Octubre-

Octubre-
Agosto-

Agosto-
Enero

Enero
2016

2016

2017

2018
2016
2016

2016

2017
2017

2017
2107
2107
2017
2107
2017
2017
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2018
2018
2018
2018
2018

2018
Actividades

Obtención de la cepa y
purificación X X X X X X X X
Identificación morfológica y
molecular X X
Preparación de
biopreparados y prueba de
viabilidad
X X
Inoculación de B. bassiana
en Sphenarium
purpurascens, in vitro X X
Análisis de Resultados en
laboratorio y escritura del
articulo X X X X X

Envió del primer Articulo X


Prueba de campo X X X X X X
Estancia de investigación y
conclusión de materias. X X X X X
Análisis de resultados de la
prueba de campo X X X X
Envío del segundo articulo X
Escritura de la Tesis X X X X X
Coloquio y examen
profesional X X