Comité de Bienestar Animal de Ética en

Experimentación Animal de la Universidad

Materiales y métodos Federal de Santa María (UFSM),

• Producción, extracción y purificación de IgY

El antígeno Vacunación Extracción Concentración

• Tripomastigotes • Solución 1:1 • P. Polietilenglicol • Ley de Lambert-

de T.cruzi • Intramuscular • PBS y PEG Beer
• Criopreservadas • (5)-25 semanas • Centrifugación • Coeficiente 1,33
• Inoculadas en • 10 días • R. Precipitado • C. proteína:
ratón • 3sm de • Filtrado + PEG Bradford con
• Parasitemia inoculación • Mezcla de
azul de
• Sobrenadante coomassie
• Blanco rodillos
recolectado • Albumina de
• Centrifugación
suero bovino
• Gránulo en PBS
• Absorbancia a
595nm
Caracterización de IgY
Caracterización: Especificidad y sensibilidad

Electroforesis Mezcla Condiciones

• Dodecil- sulfato • Tampón (Laemmli • Baño María

de sodio Sample Buffer) • 70 V (30 min)
• SDS-PAGE • 120 V(120 min)
• Postinmunización • Coomassie Blue
R
• S. Decolorante
(Ac. Ac. Glacial y
metanol)
 Western blot ELISA
0,05 M de tampón de carbonato
(pH 9,6).
Geles
(3, 5, 7, 9, 10, 11, 13) se
Antígeno diluyeron (1: 1000, 1:
(trypomastigote 2000 y 1: 5000) en FBS
s de T. cruzi, y SB
IgY Trypanosoma
evansi)
conjugado de peroxidasa IgY anti-pollo de
conjugado de IgY anti-T recién IgY conejo
peroxidasa de IgY sintetizado
anti-pollo de conejo
cromogénico (ortofenilendiamina, OPD)
solución en desarrollo
PBS-Tween bloqueó con 10 μL de H2SO4
(DAB-diaminobenzidina,
Tris HCl, níquel sulfato al 490 nm usando un espectrofotómetro
0,3% y H2O2)
 Evaluación de la citotoxicidad de IgY
Células mononucleares de sangre periférica (CMSP) Cultivo celular VERO

linfocitos se separaron mediante Histopaque 1077

centrifugación en gradiente de densidad utilizando 4 ml de

muestras de sangre

5 ml de RPMI 1640 suplementado con 10% de FBS, 1% de

penicilina y estreptomicina.

E-MEM suplementado con FBS al 10%

microplaca de 96 en una atmósfera de CO2 humidificado al 5% , 1% L-glutamina (200 mmol L1),
ciprofloxacina y anfotericina B
 Viabilidad celular Análisis
Estadístico
Shapiro-
método colorimétrico MTT 3- (4,5dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil normalidad y homocedasticidad Wilk y
tetrazolio bromuro Levene

50 μl de solución de MTT a cada pocillo

diferencias significativas
ANOVA
200 μl l de dimetilsulfóxido (DMSO)

ELISA a una longitud de onda de 560 nm. post hoc de Tukey

Resultados
Concentración de
anticuerpos IgY

Entre la 3ra y 13ra

semana fue de 8,41 ±
1,47 mg / ml.

Electroforesis en gel
SDS-PAGE

75 y 50 kDa  Cadena
pesada IgY
37 y 25 kDa  Cadena ligera Protocolo de extracción fue efectivo en la separación de
IgY IgY
.
Resultados
La segunda membrana
Ensayo Western blot
transferida electroforéticamente
Primera transferencia de
Western

Las bandas encontradas en el gel de Reaccionó con las proteínas de T. cruzi y T. evansi
electroforesis que tienen el mismo peso Indica reactividad cruzada.
molecular se refieren a IgY
 Inmunoterapia
Identificar tratamientos Método de Sampaio et
que sean más al. (2014) es eficaz y
eficientes y menos fácil de implementar para
tóxicos contra T.cruzi, la producción de IgY
anti-T. cruzi

104 y 103 tripomastigotes de T. cruzi, 8.41

mg / ml
107 tripomastigotes de T. evansi  2,7 mg /
ml. Método de precipitación de sal
Aislar y purificar IgY de pollo utilizando PEG-6000
activa funcional de la yema • Fácil de realizar
de huevo. • Anticuerpo eficaz de alto rendimiento
• Manipulación a temperatura ambiente
Precipitación salina sin riesgo de desnaturalización de la
Técnicas cromatográficas
Ultrafiltración.
inmunoglobulina.