UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA DEPARTAMENTO

ACADEMICO DE CIENCIA Y TEC. DE ALIM. Y PROD. PESQ.

FACULTAD DE INGENIERÍA PESQUERA

CURSO : MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

 CULTIVOS

Es un método para la
Es el desarrollo de bacterias
multiplicación de Mos a nivel
ydeotros Mos;
laboratorio en medios de
cultivo a nivel de laboratorio
Un buen cultivo necesita
Además de conocer los nutrientes
Combinar apropiadamente
apropiados para el cultivo de
los nutrientes
Mos necesarios
también conviene saber y las
condiciones físicas
las condiciones físicas donde
Adecuadas .
puedan desarrollarse mejor.

CONDICIONES PARA EL DESARROLLO

DE LOS MOS
CONDICIONES FISICAS NECESARIAS PARA EL DESARROLLO

Necesidades
1.Temperatura:
Cada
Las tipo determófilas
bacteria de gases
bacteria crece
puedena ciertasoyTº
Aerobio
dentro
ser
El : de cierto
desarrollo de límite
las de acuerdo
bacterias
Los gases que afectan
con estodelas
Termófilos
depende bacteriasdeselasdividen
lafacultativos
velocidad en :
reacciones
sielsudesarrollo
1. Psicrófilas: capaces
químicas crecimiento bacteriano
se extienden
de desarrollarse a
0°Cson
a la el O
óregión
menos aunquey
mesófila:.
2 CO2mejor
crecen . a Tº
superiores a 0°cercano
La T° puede determinara la
5° - 15°C. ¡uy Yo
Termófilas
2. Mesófilas verdaderas
Se o
desarrollan
velocidad de crecimiento y el gradoentre noo!
termófilos
losLas
total obligados
debacterias
límites de T° 25 – presentan
desarrollo 30°C
de los M.O.
o estenotermófilos
3. Termófilas:
una respuesta soloSisesolo crecen
variable
desarrollan
en
en
LasT°variaciones
un de 55°C
rango y en
entre no
45°se
influye
la T°desarrollan
a 55°C.
en Oprocesos
allos 2 libre metabólicos
por ello se y en
a T° de la región mesófila :. ¡somos
la dividen
morfologíaen :
celular anaerobios !
 NECESIDADES DE GASES.
Aerobios Aerobios
Aenaerobios Microaerobios
obligado facultativos
obligados
s bacterias que
bacterias que bacterias que bacterias que se crecen en
se desarrollan se desarrollan desarrollan tanto presencia de
en presencia en ausencia de en presencia como pequeñísima
de O2. O2 libre. en ausencia de O2. s cantidades
de O2 libre.

Aerobios,
 (a) Los aerobios obligados crecen
solo en la superficie.

(b) Los anaerobios, son sensibles al

oxígeno, crecen en el fondo, lejos
de la superficie.
(a) (b)

(c) Los facultativos o aerotolerantes

crecen en Todo el tubo.

(d) Los microaerofílicos tienden

a crecer cercanos a la
superficie.
(c) (d)
 Obtención de microorganismos
aerobios en grandes cantidades.

incrementar el medio a la exposición de la atmósfera

Poner el medio de cultivo en capas poco profundas, para los
cuales existen recipientes adecuados:

matraces de botellas de Roux. matraces de

Fermback kolle
 Métodos de anaerobiosis se
cámara depueden
anaeribiosis
conseguir
: :
Las bacterias Agregando al medio de cultivo un
Es una cámara
anaeróbicas
con
compuesto reductor. Ej: triglicolato de
sodio, para disminuir el contenido de O2.
se atmosfera
podrán controlada
Quitando al O2 por procedimientos
por medio
desarrollar si de gases
mecánicos
N2 y CO2.
expulsando el aire y bombeo
se toman
especiales
precauciones para el
Mediante reacciones químicas
cultivo de bacterias
especiales dentro del recipiente para que
deanaerobias consuman el O2 libre Ej:
anaerobiosis: encender una vela para
transformar el O2 en CO2.
 pH
El cambio de pH puede ser tan
notable que
La mayor parte acabetienen
de bacterias porun enturbiar
pH óptimo de
crecimiento
el medio,entre
debido6.6 al– 7.3,
pH . aunque algunas
bacterias puede desarrollarse a pH extremos 4 y 8.

Los cambios en el pH se pueden

El pH puede cambiar
prevenir como
mediante la
resultado de delasun sustancias
incorporación elemento
producidas por M.O. EJ:
paliativo (Buffer) en el medio de
ácidos
cultivo. o básicos.
 Cultivos mixtos cultivos puros

cuando en un mismo
medio de cultivo se Representa las
desarrollan diferentes condiciones
tipos de bacterias artificiales para
que pueden tener
el desarrollo de
aspectos muy
diferentes, apariencia un solo tipo de
y características M.O.,
bioquímicas.
 cultivos puros
son importantes para conocer
las características específicas de
Cada especie

Para ello el mo
se debe aislar y
cultivar como
un cultivo puro.
 Técnica de siembra
en placa: Por estrías
Métodos y rayado
para aislar
cultivos Técnica de la
puros. placa vertida.

Técnica de
enriquecimient
o de cultivo.
 Técnica de siembra por estría en Placa y por
difusión en placa.
Técnica de siembra por estrías : se pasa una porción de la muestra
a la superficie de un medio de cultivo y se siembra por estrías o por
difusión.

segundo grupo Tercer grupo Cuarto grupo

una sola estría de estrías
de estrías de estrías

Para sembrar por rayado o método francés

consiste en hacer 5 líneas paralelas con la el inoculo
sobre la superficie del medio
Luego girar la placa y hacer 5 líneas arrastrando el
inoculo hasta completar la placa
Las células bacterianas quedan
superficialmente separadas en
algunas áreas de la placa.

Utilización de un asa de cultivo como método de

transferencia aséptica
Cada colonia aislada es descendencia de una
sola célula y por lo tanto un cultivo puro.

En las especies donde las células se

agrupan de manera característica,
(Staphilococus) también son un
cultivo puro.
 Consiste en diluir la muestra en
tubos con agar fundido

Las placas
El medio se
mantiene al estado El medio con se incuban
liquido
temperatura
a una
de
el inoculo en forma
homogenizado
45°C para permitir
se vierte
invertida
Inoculo que el inoculo se
distribuya en una placa
adecuadamente en
el medio.
petri
 Esta técnica se hace de forma cualitativa o
cuantitativa.
Cuando se hace de forma cuantitativa podremos
determinar el numero de MOS
 Si no se conoce la magnitud de la población bacteriana
de la muestra
Se necesita hacer diluciones en tubos para obtener
colonias bien aisladas
1ml 1ml 1ml 1ml 1ml

9 ml
Agar
90 ml de SSP
Muestra 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-5
Agregar con una colonia estéril 1.0 ml o 0.1ml
Después de la
incubación se
examinan las placas
que tengan colonias
aisladas, para aislar 159 17 2 0
cultivos puros.. muchas colonias colonias colonias colonias colonias
mas de 300
se examinan las
placas para buscar
las que tengan
colonias aisladas, de
esta placa se
pueden aislar
cultivos puros..
 Muestra

10 ml

SSP
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5
muestras
diluidas

0,1ml

10-1 10-2 10-3 10 -4 10-5

Incubación 31ºC, 72h

Recuento
¿Cuántas
pipetas estériles
deberé de
utilizar para
evitar
contaminación y
error?
 Cuenta en placa

• Consiste en contar
colonias que se
desarrollan después
de cierto tiempo
• presupone que cada
colonia proviene de
un microorganismo
en la muestra.
– Vertido
– Superficie
 Cuenta en placa

• Consiste en contar
colonias que se
desarrollan después
de cierto tiempo
• presupone que cada
colonia proviene de un
microorganismo en la
muestra.
– Vertido
– Superficie
Para separar bacterias esporuladas

Las esporas en general, resisten hasta

80º C por 10 minutos,
Las formas vegetativas mueren al ser
sometidas tT° de 60-70º C.

Este método se emplea para aislar bacterias

del género Clostridium (esporulados).
 Factores que afectan el recuento en
placa
1. Métodos de muestreo
2. Antecedentes del alimento previos al examen
3. Temperatura y tiempo de incubación
4. pH, aW y potencial de óxido reducción
5. Tipo de diluyente
6. Existencia de otros microorganismos
competidores o antagonistas
Técnicas de enriquecimiento de cultivo.

Los
Paramedios de enriquecimiento
el crecimiento de la bacteria
Sólo
Supóngase
se usan que se quiera aislar del suelo
crecerán:
cuando:
Las bacterias que no son
alfa conidendrina
bacterias capaces de utilizar sustancias
Se debemuy
Elcapaces
químicas preparar
de metabolizar
uncomo
complejas
tipo de bacteria
Las bacterias
medio alfa –
que queremos
capaces
líquido compuesto
conidendrina.( por: sales
constituyente
aislar se encuentra en muy de de
la madera).
la alfaconidendrina
inorgánicas
utilizar alfa conidendrina
como
pequeñas cantidades fuente N 2
si se siembra en agar nutritivo directamente
yse
Yuna
esalfa
de conidendrina
desarrollarán
no crecerán.
desarrollo
muestra muy
del suelo estasen como as
coloni
lento
bacterias
fuente
no
que otrasde
crecen . carbono.presentes
especies
Este aparato permite al operador
Esta técnica se
Consiste en obtener un solo M.O.
controlar los movimientos de
a partir de una gota suspendida.
usa en estudios
una micropipeta o microcánula
muy
Se necesita un equipo especial
Dentro tubo y pasarla a un
delmicromanipulador
Como un
especializados
medio
Adaptable deal
su desarrollo.
cultivo para
microscopio .
 Mantenimiento y preservación de
cultivos puros.

Uno de los problemas del estudio de los

cultivos puros es su mantenimiento en
condiciones viables por varios periodos

La mayoría de los laboratorios de

bacteriología cuentan con una gran
variedad de cultivos puros ( colección
de cultivos).
Estos cultivos puros de M.O. se
necesitan para las clases de
laboratorio y trabajos de
investigación.

Es muy importante tenerlas

perfectamente identificadas las
bacterias de los cultivos puros
listos para usarse.
Las compañías industriales tienen
colecciones de cultivos
bacterianos.
1.Para probar la efectividad de
agentes químicos y
quimioterapéuticos.

2.Como agentes de ensayo para

antibióticos y vitaminas.
 No todas las bacterias
responden a condiciones
específicas de crecimiento.

Lo que es apropiado para un

cultivo no puede ser aplicable
para otro.
Es esencial que el método de
preservación y mantenimiento conserve
todas las características de las
especies tal como fueron en el
momento de la preservación :

Los cultivos pueden mantenerse en tubos por

algún tiempo mediante resiembra
periódica en medios frescos
 Para utilizar este método se debe de
considerar:

El medio de cultivo apropiado

para usarlo con cada cultivo.

Temperatura apropiada para

mantener los cultivos.

Tiempo que se necesita para

hacer la resiembra.
 Tiempo de T° de Almacenam
M.O. Medio resiembra incubación iento

Salmonella sp. Agar cisteína 1 mes 35° 35°C

Bacillus Sp
Agar nutritivo 12 ó más 28° 10°C
Seudomona Sp. Agar nutritivo 3 meses 28° 10°C
Clostridium Sp. 6 meses ó
Carne cocida
más 28° 10°C
La liofilización es el procedimiento más eficaz
para la preservación de cultivos.

Muchas especies de bacterias procesadas por

esta técnica han permanecido viables por más
de 20 años.

En este procedimiento las células se secan

rápidamente mientras son congeladas
mediante las siguientes etapas:
La suspensión de células se ponen
pequeños frascos que se sumergen en
una mezcla de hielo seco y alcohol (-
78°C).
Los frascos se conectan inmediatamente
a una línea a alto vacío.

Una vez que se termina el secado

cada frasco se sella bajo condiciones
de vacío.
 Las ventajas:
La gran longevidad de los
cultivos

Los pequeñísimos cambios en

las características de las células

Por ser pequeño el recipiente

donde se almacenan ocupan
poco espacio.
 Rotule el tubo con, el nombre del germen que va inocular y la
flecha en que se hace el inoculo.

Con
. la mano derecha tome la aguja de inoculación y
flaméela; sin soltarla, déjela enfriar

Sostenga el tubo con el cultivo en la mano

izquierda, remueva el tapón con el meñique
de la otra mano y sosténgalo de tal manera
que no toque ninguna superficie.

Flamee la boca del tubo

Retire una porción de cultivo.
Flamee nuevamente la boca del
tubo y tape .
Incube a 37
ºC por 24 a
En el tubo a inocular, inocúlelo,
Flamee de nuevo la boca 48 horas
haciendo una estría en su
del tubo, tápelo y colóquelo
superficie.
en la gradilla
 cultivos en agar recto

Se debe de usar la aguja de siembra recta

desde la superficie al fondo del tubo y
retirarla por el mismo lugar que se
introdujo.
Los tubos de caldo

se pueden sembrar con el asa.

Después de la siembra e incubación se
pueden determinar características más
peculiares de desarrollo en el cultivo.
Una de las características principales de
las bacterias es su apariencia como:

Aspecto, color, cromogénesis,

abundancia de crecimiento, olor del
cultivo, que sirven de guía su
identificación.
En un cultivo puro se
observa los siguientes
aspectos de cultivo:
1º. Tipo de colonias : En agar (cultivo placa).

2º. Desarrollo: En agar inclinado.

3º. Desarrollo: En caldo.

4º Desarrollo: En gelatina por picadura

 Desarrollo de las colonias en agar placas.
1º Tamaño.
Los límites de tamaño de las colonias varían
desde muy pequeñas (punta de alfiler)
hasta colonias muy grandes que miden 5 ó
10 mn de diámetro.

La mayoría de las bacterias forman

colonias de tamaño limitado

Otras como Pseudomonas se desarrollan

sobre toda la superficie del agar.
2º. Márgen o borde.
Son de diferentes tipos: Pueden formar un círculo
perfecto como los bordes de una gota

Mostrar irregularidades como salientes redondas

hendiduras, proyecciones filiformes o proyecciones
en forma de raíz.

3º. Elevación.
Pueden ser muy finas (aplanadas) o gruesas
(elevadas), las colonias elevadas muestran
diferentes grados de convexidad.
Morfología de las colonias
4º. Cromogénesis o pigmentación.
Las colonias pueden estar coloreadas
(pigmentadas) o sin color no
pigmentado, algunas especies se
caracterizan por lo matices rojo,
amarillo, café, violeta).

5º. Características ópticas.

Las hay opacas, transparentes u
opalescentes.
 Desarrollo en agar
inclinado
1º. Cantidad. Escoso moderado o
abundante.

2º. Margen o borde de desarrollo

uniforme que incluso presenta varias
irregularidades en cierta forma
similares a las colonias
desarrolladas en placas.
3º. Textura igual que las
colonias.
Consistencia mantecosa o de mantequilla
fácilmente removible con una aza de siembra.

Viscosa o filamentos secos Si forma o no

emulsión fácilmente cuando se pone en una
gota de agua.

4º. Cromogénesis o pigmentación.

Similar al de las colonias en placas.
 La cromogénesis o pigmentación.

No todas las especies bacterianas poseen

estas características de distinción.

Algunas especies productoras de pigmento,

lo retenido dentro de las células de manera
que la masa de células bacterianas se
colorea

Mientras que en otras el pigmento lo excreta

y lo que se colorea es el medio de cultivo.
La intensidad de la coloración está
influido por la composición del medio y
las condiciones de incubación.

La producción de pigmento se observa

mejor en los medios de cultivos sólidos.

Algunas de las especies bacterianas

retienen pigmento intracelular son:
Serratia marcescens rojo

St. Aureus amarillo dorado

Serratia lutea amarillo limón

Micrococus amarillo

Algunas de las bacterias que producen

pigmentos y lo escretan al medio son:

Pseudomonas flourescens verde café olivo

P. aeroginosa verde azul o café oscuro

 Desarrollo en caldo nutritivo.

1º. Cantidad de desarrollo escaso moderado o

abundante.

2º. Distribución del desarrollo en el caldo.

Uniformemente distribuido (turbidez)
uniforme desarrollo confinado a la
superficie del caldo como nata o película
fina o gruesa, o desarrollo que se acumula
como sedimento que es granular o
viscoso.

3º. Olor. Putrido, aromático, imperceptible.

 Ácido de la Glucosa
Muchas de las bacterias usan la glucosa como fuente de carbono, como parte
importante de su metabolismo.

Se determina si la bacteria usa la glucosa produciendo ácido y/o gas a partir de

dicho carbohidrato.

En un tubo con agua peptonada al 1% de glucosa

y un tubo de Durhjam, se inocula la bacteria
por agitación teniendo
Luego se incuba por 24 horas a 37°C
Si la bacteria usa la glucosa producirá ácido
y/o gas

Si produce gas, se observará una burbuja en la

campana de Durhjam.

(+) Ácido y gas a partir de la glucosa: Escherichia coli