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Aula Prática na semana que vem na Unidade Conforja!

Campus Diadema

Técnicas de Purificação e
Caracterização de Proteínas

Prof. Dr. Helotonio Carvalho

Unidade Curricular de Bioquímica Estrutural


UNIFESP – Campus Diadema

Diadema, 1º semestre de 2012


Uma célula possui milhares de proteínas diferentes, o que
torna o processo de separá-las algo extremamente difícil.

Os métodos existentes para purificação e caracterização de


proteínas têm como objetivos determinar características
físicas como peso molecular, ponto isoelétrico e número de
subunidades, bem como a natureza dos aminoácidos
constituintes e sua seqüência.
Purificação
de Proteínas
A purificação de proteínas utiliza métodos baseados em diferentes
propriedades como carga, tamanho e polaridade.

Tipicamente, é uma tarefa bastante difícil quando se parte de um


tecido, pois em muitos casos consiste em chegar a uma proteína
com pureza maior > 98% a partir de um tecido no qual ele pode
representar menos de 0,1% em peso!! Técnicas de biologia
molecular têm facilitado este processo através da produção de
proteínas recombinantes.

O processo de purificação exige uma série de etapas seqüenciais,


que enriquecem progressivamente a solução na proteína desejada.

A escolha do material de partida é crucial! Isso pode facilitar


muito a purificação. Uma proteína pode estar presente tanto na
hipófise, quanto no fígado de um animal de laboratório. O fígado,
por ser maior, deve ser o órgão de escolha.
O tipo de estratégia de purificação varia de acordo com a
localização da proteína dentro da célula, bem como o tipo de
proteína.
Uma proteína de membrana exige a solubilização da membrana
com detergente.
Proteínas fortemente ligadas ao DNA como histonas,
necessitam de quebra do núcleo e redução das interações com o
DNA (p.e. com o uso de alta concentração de sal).
Se uma proteína é mitocondrial, é mais fácil purificar esta
organela (centrifugação diferencial) a fim de reduzir o número de
proteínas contaminantes nas etapas subseqüentes.
Planejamento de um processo de
purificação de proteína

Precipitação
Escolha do de proteínas
Lise das Diálise para
material de contaminantes
células retirada de sal
partida com
(NH4)2SO4
1a etapa
cromatográfica

2a etapa
cromatográfica

Proteína pura
Métodos utilizados na lise de
tecidos e células
Liquidificador: quebra tecido conjuntivo e também as células.
Também pode romper organelas.

Homogeneizador tipo Potter: rompe as células mas deixa organelas


intactas.

Sonicação

Ciclos de congelamento/descongelamento

Detergentes

O método a ser usado depende do tipo de material inicial (tecidos,


células de mamíferos em cultura, bactérias) e do tipo de proteína em
questão. Sonicação e ciclos de congelamento/descongelamento são
mais usados para culturas de células e bactérias, enquanto
liquidificador e Potter são mais indicados para se processar tecidos.
Filtração para remoção Purificação de
componentes
de tecido conjuntivo

Extrato total celulares através de


centrifugação
Tecido misturado a Centrifugação a
diferencial
solução de sacarose 600 x g, 10 min

Sobrenadante 1
Centrifugação a
15.000 x g, 10 min

Núcleo e células
não lisadas

Sobrenadante 2

Centrifugação a
Mitocôndrias2
Sobrenadante 100.000 x g, 60 min
e lisossomos

Mitocôndria
Fração solúvel
e lisossomos
do citoplasma

Ribossomos, RE,
Golgi e fragmentos
de membrana
“Salting in” e “Salting Out”
A solubilidade de proteínas é afetada pela concentração de sal de
duas maneiras:

Em concentrações baixas de sal, a solubilidade de uma proteína


aumenta com a [sal] (“salting in”).

Em concentrações mais altas de sal, a solubilidade de uma


proteína dimimui com o aumento da [sal]. Quando a concentração
de sal é suficientemente elevada, a proteína deve estar quase
completamente precipitada (“salting out”).

Devido ao fato de a solubilidade de diferentes proteínas em alta


concentração de sal variar bastante, a técnica de “salting out” é
bastante usada nas etapas iniciais de purificação de proteínas.

O sal mais usado para esta finalidade é o (NH4)2SO4.

Testes iniciais são realizados para encontrar uma concentração de


sulfato de amônio que precipite o máximo de proteínas contaminantes
sem precipitar a proteína de interesse.
A diálise é usada para separar
moléculas pequenas de moléculas
maiores
Métodos de separação de proteínas
1-Cromatografia
Definições:
Fase estacionária (matriz sólida porosa)
Fase móvel (tampão, solvente, gás)

Tipos:
Coluna
Camada fina
Papel

Equipamentos
HPLC (High Pressure Liquid
Chromatography): amostras líquidas
 FPLC (Fast Protein Liquid
Chromatography ): proteínas em solução
CG (Cromatógrafo a Gás): amostras
volatilizáveis.
Cromatografia em coluna
Cromatografia de
troca iônica

Resina pode ser carregada


negativamente, com no caso
ao lado, ou positivamente.

As proteínas se movem a


diferentes velocidades de
acordo com sua carga no pH
do tampão utilizado.

No caso ao lado, com uma


resina carregada
negativamente, proteínas
com carga mais negativa se
movem mais rapidamente e
eluem antes da coluna.
Resinas de troca iônica

Separação de
proteínas básicas
(com carga
positiva) e neutras

Separação de
proteínas ácidas
(com carga negativa)
e neutras
Cromatografia de
filtração em gel
Separação de proteínas por
tamanho.

Proteínas maiores passam mais


facilmente, enquanto as menores
entram nos poros das esferas de
resina e demoram mais para eluir.
Cromatografia
de afinidade

Separação de proteínas
por afinidade com a
coluna.

Alta especificidade.
Métodos de separação de proteínas
2-Eletroforese
Separação baseada na migração de proteínas carregadas
submetidas a um campo elétrico.

No caso de proteínas, utiliza géis de poliacrilamida com


ligações cruzadas que funcionam como peneiras moleculares
diminuindo a migração das proteínas. Proteínas com relação
carga/massa menor têm um maior atraso na migração.

SDS-PAGE: caso especial em que se utiliza o detergente


dodecil sulfato de sódio, que se liga a todas proteínas da
amostra conferindo uma carga negativa bastante alta a estas. A
carga intrínseca das proteínas passa a ser irrelevante. Como o
SDS desnatura as proteínas, todas passam a ter uma forma
parecida e a separação ocorre, neste caso, quase que
exclusivamente pela massa da proteína.
Gel corado com
Coomassie Blue
Determinação de peso molecular
por SDS-PAGE
Focalização isoelétrica
Eletroforese Bidimensional
Eletroforese Bidimensional

Permite separar até milhares de proteínas diferentes!!


Determinação da
sequência de aminoácidos
de uma proteína
Determinação da composição de
aminoácidos por HPLC

Para a detecção dos aminoácidos por HPLC, estes são derivatizados


com um composto fluorescente (OPA, o-ftalaldeído). A identificação dos
picos de cada aminoácido se dá pela comparação com padrões. Um
pico com o mesmo tempo de retenção de um padrão identifica aquele
aminoácido.
Clivagem de uma
proteína com
Tripsina

Tripsina cliva
proteínas após
resíduos de Arg
ou Lys.
Clivagem de uma
proteína com
Quimiotripsina

Quimiotripsina
cliva proteínas
após resíduos de
aminoácidos
aromáticos.
Clivagem de uma proteína com brometo de
cianogênio

Brometo de cianogênio cliva proteínas em resíduos de metionina


Montagem da seqüência de aminoácidos da
proteína a partir dos fragmentos gerados
Sequenciamento de peptídeos através da
Degradação de Edman

 Identificar o
aminoácido
amino-terminal.

Purificar o
peptídeo com n-1
aminoácidos e
reagir novamente
com
fenilisotiocianato.

Funciona bem
com peptídeos
pequenos (até 50
aas).

Esta reação permite identificar o número de cadeias polipeptídicas


de uma proteína identificando o aminoácido NH2-terminal.
Quebra de pontes S-S
Espectrofotometria
Dosagem de proteínas por
espectrofotometria UV-Vis

A espectrofometria utiliza a
propriedade de absorção de luz
característica de uma série de
substâncias.

Espectros de absorção podem ser


usados para identificação de
substâncias, sobretudo na região do
infravermelho.

A absorção na região do espectro


visível e ultravioleta é muito usada
para medidas de concentrações de
proteínas (e ácidos nucléicos).

Qualquer reação que produza cor


pode ser acompanhada pelo seu
espectro na região do visível.
Espectrofotometria-Lei de Lambert-Beer

A=e b C Sendo A = absorbância = log I0


I
A absorbância de uma I0=intensidade de luz incidente
amostra é diretamente I=intensidade de luz transmitida
proporcional à e=absortividade molar
concentração da molécula b=caminho ótico da luz pela amostra
responsável pela absorção C=concentração da solução em estudo
Espectrometria de massa

Permite a determinação da massa de proteínas com extrema precisão!


Após se saber a massa da proteína, pode-se detectar facilmente
modificações covalentes, presença de cofatores, etc. Também pode ser
usada no sequenciamento de peptídeos.
Espectro ESI-MS de apomioglobina
(16.951 Da) de coração de cavalo
Determinação de estrutura de
proteínas por Difração de Raios X

 Raiox X incidem
sobre os átomos de
um cristal de
proteína ,sofrendo
difração.

O padrão de
difração pode ser
usado para
determinar a
posição e a
natureza destes
átomos.
Espectro de Ressonância Magnética Nuclear
(RMN) Unidimensional de uma globina
 RMN utiliza a
propriedade de
spin nuclear
apresentada por
alguns átomos e a
alteração deste
spin quando
submetido a um
campo magnético.

 1H e 13N
apresentam spin
nuclear e geram
sinais em um
espectro de RMN
Determinação da
estrutura de uma
proteína por RMN
Bidimensional