UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE MÉXICO

FACULTAD DE QUÍMICA
QUÍMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO

BIOLOGIA MOLECULAR
Profesor: M. en E.Q. Macario Morales Rodríguez

METODOS PARA LA SEPARACION DE CELULAS

«CENTRIFUGACION DIFERENCIAL»
Equipo :
Ana Jessica Jiménez Yturbide
Jarintzi Ramírez Vaca
Claudia Soria Camargo

Grupo: Q.F.B. 32 3er semestre

TOLUCA, ESTADO DE MÉXICO A 17 DE SEPTIEMBRE DEL 2014
La mayoría de las células contienen una variedad
de organelos distintos. Si se pretende estudiar una
función particular de las mitocondrias o aislar una
enzima particular del aparato de Golgi, es
conveniente aislar primero el organelo relevante
en estado purificado.
El aislamiento de un organelo particular en gran cantidad
suele lograrse mediante la técnica de centrifugación
diferencial

En tanto sean más densas que el

medio circundante, las partículas
de diferente tamaño y forma
viajan hacia el fondo de un tubo
centrifugado a distintas
velocidades cuando se colocan
en un campo de centrifugación
Para efectuar esta técnica se deben realizar
previamente algunas operaciones:

Rotura mecánica Previene la

rotura de las
de las células con vesículas de
un Las células se membrana
homogeneizador homogeneizan por osmosis
mecánico en una
solución
amortiguada
isotónica

El homogeneizado se somete a una serie de

centrifugaciones secuenciales cada vez con
mayor fuerza centrífuga
Aislamiento de una fracción microsómica por
centrifugación diferencial
PASO 1

La célula se rompe
por
homogeneización
mecánica

Los diversos organelos

membranosos se
fragmentan y forman
vesículas
membranosas
esféricas
• PASO 2
El homogeneizado de
células se somete
primero a
centrifugación de
baja velocidad para
formar pelotillas con
las partículas más
grandes, como
núcleos y mitocondrias

Las vesículas más pequeñas (microsomas)

quedan en el sobrenadante
• PASO 3
Los microsomas (fragmentos de membranas vacuolares y
reticulares del citosol) pueden retirarse del sobrenadante por
centrifugación a mayor velocidad por periodos más
prolongados

Una fracción microsómica general y ribosomas pueden fraccionarse

en distintos tipos de vesículas en pasos subsiguientes.
 Una vez que los ribosomas se
retiran, el sobrenadante consiste
en la fase soluble de la célula y
las partículas demasiado
pequeñas para retirarse por
sedimentación.

Este último paso

requiere la
ultracentrífuga,
que puede
generar
velocidades de 75
000 revoluciones
por minuto que
producen fuerzas
equivalentes a 500
000 veces la
gravedad.
Puesto que los pasos iniciales de la centrifugación
diferencial no producen preparaciones puras de un
organelo particular, casi siempre se requieren
pasos adicionales. En muchos casos se logra una
purificación adicional mediante centrifugación de
una de las fracciones a través de un gradiente de
densidad, lo que distribuye el contenido de la
muestra en varias capas de acuerdo con su
densidad.
 PURIFICACIÓN DE FRACCIONES SUBCELULARES POR
CENTRIFUGACIÓN DE EQUILIBRIO DE GRADIENTE DE
DENSIDAD

La composición de varias fracciones puede determinarse

con el examen microscópico o la medición de las
cantidades de proteínas particulares conocidas como
específicas de organelos particulares.

El medio se
compone de un
gradiente de
densidad continuo
de sacarosa y los
distintos organelos
se sedimenta hasta
que llegan a un sitio
en el tubo igual a su
propia densidad,
donde forman
bandas.
Los organelos celulares aislados
por centrifugación diferencial
conservan un nivel notable de
actividad normal, siempre que
no se expongan a condiciones
desnaturalizantes durante el
aislamiento.
 USOS
Los organelos aislados por este
procedimiento pueden usarse en sistemas
libres de células para estudiar una gran
variedad de actividades celulares, entre
ellas la síntesis de proteínas unidas con la
membrana, la formación de vesículas
cubiertas y el transporte de solutos y el
desarrollo de gradientes iónicos.
 BIBLIOGRAFIA
Karp, Gerald. (2009). Biología
Celular y Molecular: Conceptos y
Experimentos). 5a Ed. McGraw –
Hill Interamericana. México. pág.
280, 744-746