KLONING GEN

OLEH: KELOMPOK 4
1. Fuzi Khoirurifa
2. Gina Maudina
3. Muhammad Zulfan F
4. Tina Agustini
 Kloning Gen
Isolasi DNA dan Karakterisasinya

DNA Vektor

Transformasi DNA

Seleksi Sel Transforman

 Tahapan Isolasi DNA

Pelisisan dinding
dan membran sel Purifikasi
1 3 5

2 4
Isolasi Sel Pengekstraksian Presipitasi
dalam larutan
• DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur
perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler.
• Isolasi DNA/RNA merupakan langkah awal yang harus dikerjakan dalam rekayasa genetika
sebelum melangkah ke proses selanjutnya.

Isolasi DNA Kromosom
Isolasi DNA Plasmid
Isolasi DNA Metode Lysis Buffer
Isolasi DNA Metode Kit Wizard
Genomic DNA
Isolasi DNA Metode CTA (Cationic
Hexadecyl Trimethyl Ammonium
Bromide) dengan Phenol
Isolasi DNA Metode Modifikasi
CTAB (Cationic Hexadecyl
Trimethyl Ammonium Bromide)
• Prinsipnya adalah memisahkan DNA kromosom atau DNA genom dari
komponen-komponen sel lain.
• DNA plasmid merupakan wadah yang digunakan untuk kloning gen, sehingga
DNA plasmid harus di pisahkan dari DNA kromosom.
• Metode isolasi yang menggunakan larutan buffer untuk proses pemecahan
selnya.
• Dilakukan penambahan EDTA dan Proteinase-K
• Metode yang menggunakan CTAB sebagai buffer lisis yang berperan untuk
memecah membran sel inang untuk mengeluarkan DNA genom.
• Isolasi DNA dengan metode modifikasi CTAB telah mengalami modifikasi
pada berbagai tahap yaitu proses penghomogenan dengan vortex mixer untuk
membantu proses lisis sel.
 DNA vektor merupakan molekul DNA yang secara
khusus dirancang untuk membawa molekul DNA asing
yang akan dimasukkan ke dalam jasad target

BAKTERIOFAG Ukuran vektor lebih besar dari dari

PLASMID plasmid. Contohnya bakteriofag λ yang
Contoh plasmid yang telah dikembangkan yang memiliki
telah digunakan: ukuran 50 kb. DNA dalam partikel
bakteriofaga λ sebagai molekul DNA
Pbr322, pUC118 dan
untai ganda linier dengan ujung kohesif
pUC119
DNA 12 nukleotida (cos)

VEKTOR
VEKTOR LAMBDA Vektor sisipan:
Dua macam vektor yang λGT10 dan λZAP11
digunakan yaitu vektor
sisipan dan substitusi. Vektor substitusi:
λEMBL4 dan λGEM11
Jalur lisis lisogen pada bakteriofaga

Setelah masuk dalam bakteri inang, ujung

kohesif berpasangan membentuk molekul singular.
Selama tahapan ini ada dua kemungkinan yang dapat
terjadi:
• Masuk siklus lisis, DNA virus sirkuler replikasi berkali-
kali, sejumlah protein disintesis dan dalam waktu
sekitar 20 menit terbentuk 100 partikel bakteriofaga λ.
• Masuk dalam siklus lisogenik, genom bakteriofaga λ
dalam sel berintegrasi dalam DNA kromosom bakteri
inang dengan cara rekombinasi pada lokus spesifik.
 Transformasi DNA
Transformasi merupakan pengambilan DNA oleh bakteri dari lingkungan di sekelilingnya.
DNA yang berada di sekitar bakteri (DNA asing) dapat berupa potongan DNA atau fragmen DNA
yang berasal dari sel bakteri lainnya atau dari organisme lainnya.
• Contohnya E.coli, salah satu metode transfomasi dengan perlakuan kalsium klorida.
• Tetapi transformasi merupakan proses yang tidak efisien, biasanya dari seribu sel tidak lebih
dari satu sel yang tertransformasi.
• Ini berarti lebih banyak sel yang tidak kemasukkan plasmid, beberapa transforman membawa
plasmid utuh, sedangkan lainnya merupakan transforman yang membawa plasmid rekombinan,
atau merupakan sel yang kemasukkan DNA non-plasmid.
• Fragmen DNA kromosom tidak mempunyai replikon sehingga tidak dapat melakukan replikasi di
dalam sel.
• Pemasukkan DNA non-plasmid tidak membawa dampak yang nyata kecuali menurunkan
efisiensi transformasi.
• Supaya DNA yang masuk kedalam E.coli tidak mengalami perubahan susunan, sel inang E.coli
yang digunakan dipilih tidak membawa endonuklease dan tidak terjadi rekombinasi antara
molekul DNA.
• Dalam hal ini dipilih sel inang yang gena restriksi endonukleasenya dan gena recA telah
dihilangkan tetapi masih mempunyai gena modifikasi
 Seleksi Sel Transforman
Contohnya pBR322 membawa fragmen DNA kromosom
pD BamHI, identifikasi dilakukan dalam dua tahap.
• Pertama, sel dari campuran transformasi ditumbuhkan
pada media padat yang mengandung ampisilin.
• Hanya sel yang membawa pBR322 atau pBR322
rekombinan yang dapat hidup karena plasmid ini gena
amp’ masih utuh.
• Sel yang tidak tertransformasi peka terhadap
ampisilin.
• BamHI pada pBR322 terletak dalam gena tetr sehingga
penyisipan DNA dalam gena ini merusak gena tetr.
• Oleh karena itu sel yang membawa plasmid
rekombinan resisten terhadap ampisilin dan peka
terhadap tetrasiklin.
• Sel yang membawa pBR 322 utuh, gena ampr dan tetr
tetap utuh sehingga sel ini resisten terhadap ampisilin
dan tetrasiklin
• Tahap kedua adalah membedakan antara
kedua jenis transforman itu.
• Sel yang tumbuh dalam medium yang
mengandung ampisilin dipindahkan ke dalam
medium yang mengandung tetrasiklin.
• Sel yang hidup pada medium yang
mengandung tetrasiklin berarti membawa
pBR322 utuh.
• Sedangkan sel yang tidak hidup pada
medium yang mengandung tetrasiklin, peka
terhadap tetrasiklin, membawa pBR322
rekombinan

Kesimpulan
• Isolasi DNA merupakan teknik pemisahan
DNA dari zat-zat lain selain DNA.
• Isolasi DNA memiliki beberapa tahapan,
yaitu isolasi sel, lisis dinding dan membran
sel, ektraksi dalam larutan, purifikasi, dan
presipitasi.
• Metode-metode untuk isolasi DNA yaitu:
1. Isolasi DNA kromosom
2. Isolasi plasmid
3. isolasi DNA metode Lysis Buffer
4. Kit Wizard Genomic DNA
5. CTA (Cationic Hexadecyl Trimethyl
Ammonium Bromide) dengan Phenol
6. Modifikasi CTAB (Cationic Hexadecyl
Trimethyl Ammonium Bromide).
• Vektor merupakan molekul DNA yang
membawa suatu DNA asing ke sel inang,
dengan harapan sifat yang ada pada DNA
asing tersebut bisa terekspresi dalam sel
inang. Salah satu vector yang bisa digunakan
untuk membawa molekul DNA asing masuk
dalam sel inang adalah plasmid.
• Transformasi DNA merupakan pengambilan
DNA oleh bakteri dari lingkungan di
sekelilingnya.
• Seleksi sel transforman contohnya pada
pBR322 membawa fragmen DNA kromosom
pD BamHI, identifikasi dilakukan dalam dua
tahap.
1. Sel dari campuran transformasi
ditumbuhkan pada media padat yang
mengandung ampisilin.
2. Membedakan antara kedua jenis
transforman itu.
TERIMAKASIH