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UESB-DCN

CULTURA BACTERIANA E FÚNGICA

Maria Lúcia Garcia Simões


2005
Cultivar microrganismos

DEFINIÇÃO

Multiplicar os microrganismos
“in vitro”
Cultivar microrganismos

REQUISITOS

Conhecer as suas exigências físico


químicas, que variam de um grupo
para outro

Dar condições necessárias para que


se multipliquem
Cultivar microrganismos

OBJETIVOS
Cultivar microrganismos
Agente Etiológico de um Processo Infec-
cioso Podridão mole da batata
Cultivar microrganismos
Agente Etiológico
Nematóide ?

Vírus ?
Bactérias?

Fungos ?
Agente- Cultura
Isolamento
Erwinia carotovora
Amidalite

Estafilococus
aureus
Cultivar microrganismos

• Agente Responsável por um Processo Be-


néfico
Cultivar microrganismos
Conservação de microorganismos de inte-
rêsse
Cultivar microrganismos

Dar condições necessárias para que se

multipliquem

Conhecer as suas exigências físico

químicas, que variam de um grupo para outro


Parâmetros Físicos
Temperatura
- Extremófilos- 106 oC -Thermococcus, Pilobolus

- Termófilos: 50- Bacillus - áreas vulcânicas,


fertilizantes.

- Mesófilos : 37oC- Escherichia coli

-Psicotróficos: 15 oC

- Psicrófilos: 4oC- oceanos, regiões polares-


Pseudomonas
Reações
enzimáticas
Em taxa máxima

Reações enz. em
em velocidade
logarítmica

Adaptação:transp Desnat. De proteínas


. De memb.baixo, Colapso da memb.
Sem multip. Lise térmica
pH ótimo
 Acidófilos pH 0 a 5.5
 Neutrofilos 5.5 a 8.0
 Alcalofilos pH 8.5 a 11.5
 Alcalófilos Extremos
pH 10.0 ou acima
Plasmólise

Dessecação- para Dessecação intensa


a multiplicação
Morte celular
Plasmoptise

H2O

Lise celular
Parâmetros Químicos
Carbono e H2O : carboidratos (lipí-
deos, proteínas) síntese de componentes
celulares orgânicos

Nitrogênio, Enxofre e Fósforo : DNA,


RNA, ATP, Aminoácidos

Traços de elementos: cofatores enzi-


máticos
Oxigênio
Aeróbios estritos O2 molecular- 21%

Anaeróbios Facultativos respiração aeróbia


ou fermentação na ausência de O2

Anaeróbios Obrigatórios O2 a partir da H2O

Anaeróbios Aerotolerantes sobrevivem


mas não se multiplicam na presença de O2

Microaerófilos concentrações de O2 menores


que a atmosferica- 1 a 15%
 Respiração O-2
 radicais superóxidos
 tóxicos- remoção de elétrons em
cascata
 Aeróbios – produzem SOD
 superóxido dismutase
 neutraliza O-2 H2O2 + O2
Peróxido de hidrogênio H2O2
 também tóxico
inativado pela produção de catalase
e peroxidase

H2O2 + 2 H+ = 2 H2O

 Anaeróbios obrigatórios
 não produzem SOD nem catalase
com acúmulo de O-2 no citoplasma
Bac.Entéricas Neisseria
Pseudomonas
Enterococcus
aeróbios
Clostridium
Bicarbonato e Paládio
boroidreto de
Na + H2O
CO2 H
CO2 H

+
Paládio

H2O
Oxigênio é
retirado
Jarra para Microaerofilia

3% CO2

10% CO2
Growth Curve
Constant per-capita death
Death rate = Birth rate (exponential).
rate.

Division at constant rate


(exponential).

Time of gearing up for


division following change in
culture conditions.
Coleta de Material

Evitar o acúmulo de contaminantes na a-


mostra
Preservar o microrganismo vivo para iso-
lamento e análise
Usar técnicas específicas de coleta de a-
cordo com :
tipo de material
sintomatologia
suspeita do agente etiológico
Meios de Cultura- Bactérias

Definição
Classificação
Classificação quanto à
Classificação quanto à origem dos
constituintes:

 Meios naturais ou complexos

Contêm substâncias de origem biológica,


como extrato de carne, de malte, etc.,
portanto de composição química muitas
vezes não definidas.
 Meios sintéticos

Todos os constituintes são substâncias


isoladas, têm a composição conhecida e
constante e são indicados para trabalhos
de pesquisa
Classificação quanto à natureza dos
constituintes
 Minerais: todos os componentes que são
minerais
 Mistos: fontes de C e componentes
minerais
 Orgânicos: fontes de C, N e S
 Completos: meios orgânicos acrescidos de
fatores de crescimento como vitaminas e
oligoelementos
Classificação quanto à finalidade
 Meios de crescimento e conservação:

Meios cuja composição atende às


exigências nutritivas dos microrganismos,
possibilitando o desenvolvimento em
condições satisfatórias.
 Meios para fins especiais: são meios que
estimulam a capacidade que certos
microrganismos têm, como formação de
esporos, produção de enzimas, etc.
Classificação quanto ao Estado
Físico-

 objetivos
 Liquido: coleta e transporte
 Sólido: isolamento e contagem
 Semi- sólido: motilidade
Meio líquido: transporte / crescimento

Turvo Início
crescimento límpido
Meios sólidos- isolamento 1assepsia
2 inoculação
2
identificação
de colônias
3
reisolamento
purificação
Classificação quanto ao objetivo da
cultura
 Meios de enriquecimento:

 adição ao meio de determinadas


substâncias que favorecem o
desenvolvimento de certas linhagens
 Substâncias altamente nutritivas
 Proteínas (sangue, plasma), aminoácidos,
extrato de órgão de mamíferos, proteína
de soja.
Staphylococcus aureus producing zones of both
complete and incomplete hemolysis on blood agar.
Staphylococcus epidermidis
Streptococcus beta hemolítico
Streptococcus alfa hemolítico
S. viridans
Streptococcus gama hemolítico-
S. faecallis
Meios seletivos: permitem dominância absoluta
e o crescimento muito mais rápido do
microrganismo que se procura isolar.
Crescimento de uma população microbiana do solo adaptada
em meio de cultura enriquecido com 0,5 mmol L-1 de
glifosato
Meios Diferenciais:

Põem em evidência determinadas propriedades


úteis para identificação de diferentes espécies.

Ex: a capacidade fermentativa de açúcares,


lançamento de metabólitos ao meio, fazendo
alterar o pH do mesmo, tamanho e aspecto de
colônias, etc., que irão auxiliar na diferenciação
de uma espécie para outra.
Meios de Cultura Diferenciais
Figura meio diferencial
S. Aureus em M. Telurito- Glicina E. Coli em M. Metileno Eosina- EMB

Meios Seletivos

Enterobacter em M. EMB Pseudomonas em Agar Pseudomonas


Métodos de Semeadura

Semeadura por Varredura ou Esgo-


tamento
Técnica Pour- Plate e Alça de Drigalsky
Crescimento bacteriano

 Definição:Aumento de biomassa / Nº cels


/ tempo
 Taxa de crescimento: mudanças no n° de
cels. / tempo
 Tempo de geração: tempo requerido para
produzir uma geração/ tempo
Quantificação do crescimento
 Determinação da biomassa (massa
celular):
 Peso seco: g/mL, g/L
 Quantidade de proteína: proporcional ao
nº de células
 Contagem direta em câmaras de
Neubauer
 NMP / UFC: número mais
provável:diluição e semeadura
 Espectrofotometria
Determinação da biomassa (peso
seco):

Filtração
A
vácuo
Pp filtro com
biomassa

Estufa: até peso


constante

Dessecador
Contagem direta: câmara de Neubauer
Si contamos las cuatro áreas sombreada (L) observando un
total de x células entre las cuatro áreas, la concentración en la
suspensión celular será :
concentración en la suspensión (células / mL) = 10000 (x/4)
Viable Counts: Plate Counts
Técnicas de Conservação de Culturas

Refrigeração: períodos curtos

Congelamento: -50 a -90oC

Liofilização: congelamento a e retirada


da água por vácuo a –54 a -72oC

Castelani: glicerol a - 80oC

OBS: tipo de microrganismo


Crescimento Microbiano
Divisão Binária Simples
Conjugação
Divisão
Binária
Simples

Note that not all


daughter cells fully
separate after
division, e.g.
streptococci, etc.
Cultivo de Microrganismos por Turbidome-
tria Automatizada
BIOSCREEN C
 Placas de microvultivos
 Parâmetros cinéticos padronizados
 Gasto de material
 Tempo de trabalho
 Leitura automatica das absorbâncias
Curva de crescimento por software
acoplado
Curvas de crescimento de Rhizopus microsporus em diferentes fontes de carbono
por método turbidométrico

Tempo lactose sacarose maltose glicose glicerol sorbitol frutose xilose galactose
0 0,284 0,286 0,283 0,31 0,321 0,32 0,34 0,357 0,3
4 0,237 0,375 0,365 0,37 0,314 0,326 0,381 0,374 0,235
8 0,278 0,442 0,501 0,768 0,38 0,395 0,674 0,436 0,408
12 0,325 0,495 0,64 1,012 0,425 0,431 0,919 0,484 0,58
16 0,369 0,534 0,768 1,172 0,472 0,462 1,11 0,514 0,709
20 0,478 0,628 0,986 1,277 0,929 0,543 1,236 0,666 0,965
24 0,791 0,859 1,214 1,321 1,585 0,817 1,309 1,082 1,158
28 1,152 1,221 1,382 1,345 1,742 0,925 1,39 1,483 1,252
32 1,289 1,358 1,441 1,321 1,797 1,054 1,425 1,631 1,356
36 1,399 1,464 1,52 1,337 1,884 1,157 1,52 1,732 1,429
40 1,503 1,54 1,615 1,364 1,972 1,224 1,636 1,837 1,53
42 1,599 1,623 1,714 1,406 2,08 1,313 1,769 1,962 1,602
46 1,657 1,674 1,766 1,419 2,12 1,406 1,828 2,063 1,611
50 1,711 1,723 1,782 1,42 2,158 1,497 1,89 2,19 1,624
52 1,784 1,813 1,86 1,43 2,206 1,585 1,942 2,305 1,664
60 1,834 1,896 1,946 1,453 2,258 1,721 2,035 2,404 1,715
Curva crescimento de Rhizopus sp. em diferentes fontes de carbono

2,5
lactose
sacarose
2
maltose
glicose
Abs.

1,5 glicerol
sorbitol
1 frutose
xilose
0,5
galactose

0
0 10 20 30 40 50 60 70

Horas
F I M