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Biología Molecular
Biología Molecular
Proporciona herramientas moleculares para el
diagnóstico.
Detecta genomas de patógenos en muestras de
pacientes.
Caracterizar al agente causal de la enfermedad.
Comprender mejor los mecanismos patológicos
a nivel molecular.
ADN es el blanco para el diagnóstico.
Organización del material genético
Dogma Central de la
Biología Molecular
Transcripción Traducción
Replicación ADN ARN Proteína
Molécula de ADN
Nucleótidos:
A, T, G, C
◦ pb = pares de bases
◦ Humano: 3 x 109 pb
Fosfato
Pentosa
Molécula de
ADN
Estructura del ADN
Biología Molecular
El principio para el uso de los ácidos nucléicos es
la complementaridad de secuencias entre hebras
independientes que forman espontáneamente
estructuras de doble hélice.
La complementaridad de dos
hebras es la base del uso de
sondas de ácidos nucléicos
Enzimas que afectan al ADN
Endonucleasas son enzimas que hidrolizan
los enlaces fosfodiéster internos de los
ácidos nucléicos y que lo fragmentan en
oligonucleótidos.
Exonucleasas son enzimas que hidrolizan
los enlaces fosfodiéster finales de los ácidos
nucléicos, es decir, los de las posiciones 5' y
3' y lo fragmenta en sus nucleótidos
constituyentes
Endonucleasas de restricción son
endonucleasas que se fijan sobre sitios
palíndromos. Ej. GAATTC
CTTAAG
Enzimas de Restricción
Análisis de ADN
Análisis de ADN
Extracción de ADN
Etapas:
Pasos necesarios para una correcta
extracción y purificación del ADN
mediante un procedimiento químico
son:
Lisis de las células o virus
Degradación de la fracción
proteica asociada al ADN
Purificación
Extracción de ADN:
Lisis de las células
Consiste en romper las estructuras que
confinan el citoplasma y liberar al medio
su contenido.
Debe romperse la estructura
tridimensional de macromoléculas como
las proteínas o los ácidos nucléicos con
sales.
La adición de un detergente como el
SDS se utiliza para eliminar las
membranas.
Extracción de ADN:
Métodos de Lisis celular
Entre los métodos para la liberación de los
ácidos nucléicos se encuentran:
Hervir en agua destilada o tampón de
PCR
Uso de detergentes con o sin calor
Hidróxido sódico con calor
Ciclos de congelación - descongelación
SDS - proteinasa K
Ácido perclórico
Enzimas (lisozima)
Sonicación
Extracción de ADN:
Degradación de la fracción
proteica asociada al ADN
Fases:
Precipitación del ADN
Lavado del “pellet”
Recuperación
Extracción de ADN:
Purificación
Recuperación
El sedimento se puede resuspender
en agua o tampón Tris tras ser secado
completamente.
Extracción de ADN
Extracción de ADN:
Virus o célula
Métodos de
Detección de ADN
Métodos de detección de ADN
dNTPs
Cebadores de PCR
Sonda Taqman
Reportero “Quencher”
PCR
PCR
Reacción en Cadena de la Polimerasa
Consiste en amplificar selectivamente
una secuencia del genoma.
Es una amplificación de
ADN in vitro
Se utilizan cebadores
específicos
La duplicación de la
secuencia blanco ocurre
de una manera exponencial
Se utilizan termocicladores
PCR: Componentes
Tampón o “Buffer” de amplificación
Contienen KCl, Tris y MgCl2
Cebadores o “Primers”
complementarios a cada uno de los extremos 3‘
Desoxinucleótidos trifosfatos (dNTPs)
Taq-polimerasa
Polimerasa resistente a las altas temperaturas
Aislada de la bacteria Thermus aquaticus
ADN muestra
Corresponde al analito
Cebadores o “Primers”
Cebador
Alineamiento
Cebador
Elongación
Extensión
PCR
PCR
Tipos:
PCR convencional
PCR en Tiempo Real
RT- PCR
PCR
Convencional
Molde
Peinilla
Equipo de Electroforesis para ADN
Cámara de Electroforesis para ADN
Transiluminador
Fotografía
Cámara Polaroid
Fotodocumentador
Electroforesis de ADN
PCR
en Tiempo Real
Los equipos de amplificación llevan
incorporados un sistema de detección de
fluorescencia.
Se utilizan moléculas específicas
denominadas fluoróforos y quenchers.
La amplificación de ADN es monitoreada,
en tiempo real, midiendo la señal de
fluorescencia generada en el tubo de
reacción.
Analizador
COBAS
TaqMan 48
PCR en
Tiempo
Real
PCR en
Tiempo Real
PCR
en Tiempo Real
La señal de fluorescencia es medida en cada ciclo
de amplificación y es proporcional a la cantidad de
producto de PCR acumulado.
Para la detección por fluorescencia se utiliza:
SYBR Green (tinte de unión al ADN )
Sondas TaqMan secuencia específica
Se sustituyen los pasos de electroforesis y análisis
de imagen de una PCR convencional.
Curvas de Crecimiento correspondientes al ARN de interés para una
serie de diluciones que abarca un intervalo de 5 unidades Log 10
Fluorescencia normalizada
Titulo
más alto
Titulo
más bajo
Número de ciclos
PCR en tiempo real utilizando sondasTaqMan
asignado
Número de ciclos
Desnaturalización
a del DNA por calor Alineación del Primer y
de la Sonda
Crecimiento
Exponencial
del DNA
Primer Reportero
directo fluorescente
Bloqueador Primer
Polimerasa (quencher) reverso
Z05
Ciclos
subsecuentes
de PCR
inmunopaedia.org
PCR
Si
es necesaria proseguir una
caracterización, los fragmentos
amplificados por PCR pueden ser
analizados mediante:
Polimorfismos en la Longitud de
los Fragmentos de Restricción
(RFLP)
Secuenciación del ADN
Secuenciación de ADN