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Universidade Federal de Pernambuco

Centro de Tecnologia e Geociências


Departamento de Engenharia Química
 
 

CROMATOGRAFIA INSTRUMENTAL

Aula 1 - Cromatografia: histórico e fundamentos.

Profa. Daniella Napoleão


Programa da Disciplina
DIA ASSUNTO
Apresentação da Disciplina / Introdução a Cromatografia: histórico e fundamentos.
Classificação das técnicas cromatográficas.
Parâmetros Cromatográficos
Fase estacionária e fase móvel. Colunas e suportes.
Sistemas de Detecção: teoria, características e aplicações.
Análise qualitativa. Técnicas de isolamento e identificação.
Análise quantitativa. Métodos de medição da área de cálculo.
Discussão de métodos analíticos.
1 Exercício Escolar
Aula Prática – Cromatografia Gasosa
Aula Prática – Cromatografia Gasosa
Aula Prática – CLAE
Aula Prática – Cromatografia Gasosa / Espectrometria de Massas
Aula Prática – CLAE
2 Exercício Escolar
Segunda Chamada
Exame Final
Cromatografia: histórico e fundamentos.

Análise Química de Misturas Complexas

Conceitos Fundamentais

•Analitos: substâncias ou espécies químicas que se deseja


caracterizar quantitativamente;
•Interferentes: substâncias que interferem diretamente no
resultado da análise dos analitos;
•Matriz: conjunto de substâncias que compõem a amostra,
excetuando-se os analitos;
•Solvente: fluido empregado no sistema com o objetivo de
dissolver os analitos, auxiliando no processo de separação dos
componente da amostra.
Cromatografia: histórico e fundamentos.

Cromatografia
1900: Tswett, botânico polonês, trabalhando com colunas de
adsorção conseguiu separar pigmentos de plantas.
Para que serve?
• Técnica empregada na separação e identificação de
substâncias.

• Baseia-se na repartição de analitos em basicamente duas


fases: móvel e estacionária.

• A separação ocorrerá, entre outros fatores pela diferença


da constante de equilíbrio entre as duas fases. Polaridade
dos solventes escolhidos.
Cromatografia: histórico e fundamentos.
Cromatografia: histórico e fundamentos.

HISTÓRICO DA CROMATOGRAFIA

•1938: Izmailov e Schraiber utilizaram a técnica de cromatografia


em camada delgada para separação de produtos farmacêuticos.
•1941: Martin e Synge desenvolveram a técnica de cromatografia
por partição (líquido-líquido) que levaram ao surgimento das
cromatografia líquida e gasosa. Receberam o Prêmio Nobel.
•1944: É desenvolvida a técnica de cromatografia em papel, que
apresenta como vantagem o fato de ser rápida e precisar de pequena
quantidade de analito.
•1959: Desty produziu a primeira coluna capilar de vidro.
Conseguiu separação de hidrocarbonetos em nafta de petróleo. Algo
surpreendente para época.
Cromatografia: histórico e fundamentos.

HISTÓRICO DA CROMATOGRAFIA

•1964: Grob aprimorou a técnica desenvolvida por Desty


utilizando colunas capilares com recobrimento interno. Conseguiu
separar componentes oriundos da fumaça de cigarros com boa
eficiência.

•1978: A técnica de colunas capilares passa a ser dominada.


Cromatografia: histórico e fundamentos.

Cromatografia
Etapas do Processo

Muitas vezes, a diferença de coloração não será suficiente


para definir as duas primeiras etapas, podendo necessitar do
auxílio de reveladores, entre outros fatores.
Cromatografia: histórico e fundamentos.

Cromatografia
Etapas do Processo
Cromatografia: histórico e fundamentos.

Cromatografia: Porque empregá-la? Onde é utilizada?


Cromatografia: histórico e fundamentos.

Técnicas cromatográficas
Os métodos de identificação por cromatografia podem ser
classificados de diferentes formas.
Cromatografia: histórico e fundamentos.

Cromatografia Planar
Cromatografia em Papel: a mais simples de todas, em que se
emprega o princípio da partição, empregando dois diferentes
líquidos:
• o primeiro ficará impregnado (fixado)na fase sólida (papel);
• o segundo será a fase móvel.
Cromatografia: histórico e fundamentos.

Cromatografia Planar
Cromatografia em Papel: necessária a correta escolha do
solvente para fase móvel, garantindo uma melhor separação dos
componentes da mistura.
Cromatografia: histórico e fundamentos.

Cromatografia Planar
Cromatografia em Papel : os compostos são separados entre a
fase aquosa estacionária e o solvente em movimento no papel.

Principal aplicação: compostos altamente polares ou


polifuncionais (açúcares, aminoácidos, pigmentos naturais).

Formas de desenvolvimento do cromatograma: trata da


maneira com que o solvente elui, pode ser de 3 tipos:

• Ascendente;
•Descendente;
•Radial.
Cromatografia: histórico e fundamentos.

Cromatografia Planar
Cromatografia em Papel – CUIDADOS

• Manter o equilíbrio da mistura de solventes que serão


difundidos no papel para separação.

•Temperatura: a variação desta variável poderá aumentar ou


diminuir a capacidade de resolução da técnica.

A temperatura ideal depende: da amostra analisada, do


papel empregado, da fase móvel utilizada.
Cromatografia: histórico e fundamentos.

Cromatografia Planar
Cromatografia em Camada Delgada (CCD): empregada em
análises qualitativas rápidas, é eficiente no isolamento de
pequenas quantidades de misturas complexas.

Fase estacionária: sólido finamente dividido que irá revestir


um material de suporte rígido e inerte. Formarão a chamada
placa cromatográfica.

Fase móvel: ficará contida em uma cuba, que migrará através


da fase estacionária.
Cromatografia: histórico e fundamentos.

Cromatografia Planar
Cromatografia em Camada Delgada (CCD)

Aplicação da amostra:

1.A reta de origem deve está localizada a cerca de 1,0 a 2,5 cm


da borda inferior da placa.
2.A aplicação deve ser realizada com o auxílio de um tubo
capilar tocando levemente a extremidade oposta aquela que
contém a amostra. (Leves toques por 3 vezes) CUIDADO!
Cromatografia: histórico e fundamentos.

Cromatografia Planar
Cromatografia em Camada Delgada (CCD)

Determinação da substância:
Cálculo do fator de retenção ou
retardamento (Rf).
Cromatografia: histórico e fundamentos.

Cromatografia Planar

Chromatotron: cromatografia de camada fina, acelerada


centrifugamente. Pode substituir cromatografias em colunas.
Cromatografia: histórico e fundamentos.

Cromatografia em Coluna
Cromatografia: histórico e fundamentos.

Cromatografia em Coluna
Cromatografia: histórico e fundamentos.

Cromatografia de exclusão: conhecida também


como filtração em gel ou separação por peneiras
moleculares, separa os componentes segundo o tamanho
efetivo (raio hidrodinâmico) das moléculas.

Nesse caso, moléculas grandes não conseguem penetrar


no interior do suporte e movem-se mais rapidamente ao
longo da coluna de onde emergem primeiro, enquanto que
as moléculas pequenas vêm a sua velocidade de
deslocamento retardada porque penetram no gel, portanto,
emergem da coluna mais tardiamente.
Cromatografia: histórico e fundamentos.

Cromatografia de adsorção: as separações ocorrem através de


interações eletrostáticas e forças de Van Der Waals entre a fase
estacionária e os componentes a separar da fase móvel.
Cromatografia de Partição: baseia-se nas diferenças de
solubilidade dos componentes na fase estacionária e da fase
móvel.
Cromatografia de Afinidade: ocorre uma ligação molecular
específica e reversível entre o soluto e um ligante imobilizado na
fase estacionária.
Cromatografia por troca iônica: a separação ocorre devido
diferentes tendências dos componentes iónicos ou ionizados
permutarem com iões da fase estacionária, que, assim, são
deslocados para a fase móvel.
Cromatografia: histórico e fundamentos.

Cromatografia em Coluna
De acordo com a classificação da fase móvel vimos que as
técnicas cromatográficas podem ser divididas em: líquida,
gasosa e fluido supercrítico. Estudemo-nas separadamente.
1)Cromatografia Líquida:
Na cromatografia líquida clássica o recheio da coluna é
utilizado geralmente uma só vez, porque parte da amostra
é adsorvida irreversivelmente.
Na cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)
utiliza-se uma coluna fechada, é portanto, reaproveitável
podendo ser usada centenas de vezes.
Cromatografia: histórico e fundamentos.

Cromatografia em Coluna
1)Cromatografia Líquida
CLAE:
Cromatografia: histórico e fundamentos.

Cromatografia em Coluna
1)Cromatografia Líquida
Fase móvel para CLAE
oSolventes com alto grau de pureza, ou misturas de solventes,
observando a polaridade requerida na separação.
oTipos de eluição: isocrática (único solvente); com gradiente
(mais de um solvente é empregado e diferem entre si pela
polaridade).
oNormal ou reversa.
2) Cromatografia Gasosa (CG): é necessário verificar se a
substâncias a serem separadas são possíveis de ser arrastadas
pelo gás.
Precisam ser voláteis e termicamente estáveis,.
Cromatografia: histórico e fundamentos.
Cromatografia em Coluna
2) Cromatografia Gasosa
Cromatografia: histórico e fundamentos.

Cromatografia em Coluna
2) Cromatografia Gasosa
Cuidados Importantes:
• Escolha correta da coluna;
• Temperatura da coluna;
• Injeção;
• Tipo de detector;
• Temperatura do detector, da injeção;
• Determinação do tempo de retenção dos compostos.
Cromatografia: histórico e fundamentos.

Cromatografia em Coluna
2) Cromatografia Gasosa
Emprego:

•Separação de compostos volatilizáveis, ou seja, separação


de analitos que apresentam uma razoável pressão de vapor à
temperatura de separação.

Importante: Ao aumentar o caráter iônico de um composto,


tem-se uma diminuição da volatilidade, reduzindo assim a
capacidade de separação via cromatografia gasosa.
Cromatografia: histórico e fundamentos.

Cromatografia em Coluna
3) Cromatografia de Fluido Supercrítico

Esta técnica começou a ser estudada quando foi verificada a


necessidade de uma fase móvel que apresentasse
características físico-químicas intermediárias entre gases e
líquidos.

A FASE SUPERCRÍTICA: a condensação de um vapor ou a


evaporação de um líquido é uma etapa descontínua, mas é
possível passar de uma fase para outra mantendo a mistura
homogênea. A fase supercrítica pode ser obtida
controlando a pressão através de um processo
isotérmico.
Cromatografia: histórico e fundamentos.

Cromatografia em Coluna
3) Cromatografia de Fluido Supercrítico
Fluido
Supercrítico

Diagrama de fases genérico.


Cromatografia: histórico e fundamentos.

Cromatografia em Coluna
3) Cromatografia de Fluido Supercrítico

Instrumental: composto por um recipiente para a fase


móvel, um injetor, uma coluna em um forno, um restritor e
um detector.

Fase Móvel: a mais usada para a cromatografia de fluidos


supercríticos é o dióxido de carbono, porque é um
excelente solvente para uma variedade de moléculas
orgânicas.
Cromatografia: histórico e fundamentos.

Fatores que Controlam a Separação Cromatográfica

COMO SE DÁ A SEPARAÇÃO EM MÉTODOS QUE


EMPREGAM COLUNA?

Coluna: tubo estreito recheado por um sólido inerte, que tem a


função de reter a fase estacionária em sua superfície.

A fase móvel, portanto, irá passar pela coluna ocupando os


espaços vazios das partículas que compõem o recheio.
Cromatografia: histórico e fundamentos.

Para que possa ocorra uma boa separação dos componentes é


preciso está atento para alguns fatores.
1)Fase estacionária: a polaridade desta fase irá determinar, por
exemplo, a ordem de separação dos componentes. Para tal é
necessário uma análise preliminar do que se deseja separar.
FASE ESTACIONÁRIA É APOLAR: Nesse caso os
componentes serão separados em ordem crescente de seus pontos
de ebulição. FASE REVERSA.
FASE ESTACIONÁRIA É POLAR: agora a ordem de eluição
dos componentes não respeitará o aumento do ponto de ebulição,
podendo dois componentes eluírem juntos. FASE NORMAL.

Força intramolecular Separação dos componentes.


Cromatografia: histórico e fundamentos.

Fase estacionária
Cromatografia: histórico e fundamentos.

2) Variáveis cinéticas que afetam a coluna: quando se trabalha


com cromatografia em coluna alguns fatores cinéticos irão
interferir na eficiência da coluna.

•Quanto menor a velocidade de transferência de massa entre o


soluto e as partículas da coluna, maior alargamento da banda na
saída da coluna.

Diante do exposto um fator que influenciará diretamente no


processo de separação é a vazão da fase móvel.

2.1) Vazão da fase móvel: o tempo que a fase móvel permanece


em contato com a fase estacionária é fator preponderante para uma
boa resolução do pico, de modo que a vazão da fase móvel deve
ser avaliada com critério.
Cromatografia: histórico e fundamentos.

Exercício: De posse do artigo distribuído em sala, identifique:

a)Os analitos, os interferentes, a matriz e o solvente empregados.


b)As etapas do processo utilizado.
c)A área em que a técnica cromatográfica foi aplicada.
d)O método cromatográfico empregado considerando: a fase
estacionária e o modo de separação.
e)Se o processo utilizou coluna. Caso afirmativo, que tipo de processo
de separação foi empregado?
Universidade Federal de Pernambuco
Centro de Tecnologia e Geociências
Departamento de Engenharia Química

Técnicas Cromatográficas

Fatores que interferem na eluição


cromatográfica.

Implantação do Método Cromatográfico

Profª. Daniella Carla Napoleão


Técnicas Cromatográficas
Técnicas Cromatográficas

Vimos na aula passada que a cromatografia podia ser dividida


em dois métodos principais: a cromatografia planar e a
cromatografia em coluna.

Cromatografia Planar: a fase estacionária é suportada sobre


uma superfície plana ou nos interstícios do papel. Aqui a fase
móvel se moverá sobre a fase estacionária por capilaridade
ou por ação da gravidade.

Cromatografia em Coluna: a fase estacionária é mantida em


um tubo estreito através do qual a fase móvel passará sob ação
de uma pressão.
Técnicas Cromatográficas

Classificação dos métodos cromatográficos em coluna

CROMATOGRAFIA 1. Gás-Líquido
GASOSA 2. Gás-sólido

1. Líquido-líquido ou partição
CROMATOGRAFIA
2. Líquido-sólido ou adsorção
LÍQUIDA
3. Troca Iônica
4. Exclusão por tamanho
5. Afinidade
CROMATOGRAFIA
COM FLUIDO
SUPERCRÍTICO
Técnicas Cromatográficas

Como ocorre a Eluição em coluna?

A fase móvel irá ocupar os espaços vazios entre as partículas do


recheio.

1.Uma solução contendo a mistura dos componentes que se


deseja separar é introduzida na coluna em um tempo t0.
2.Os componentes da mistura serão distribuídos entre as fases
móvel e estacionária.
3.A eluição se dá quando o composto é arrastado através da
coluna por uma adição contínua da fase móvel.
4.Na cromatografia moderna utiliza-se uma bomba para que a
eluição aconteça.
Técnicas Cromatográficas

Como ocorre a Eluição em coluna?’


Técnicas Cromatográficas

Como ocorre a Eluição em coluna?

Uma vez introduzida a fase móvel o eluente irá forçar a porção


da amostra cotida na fase móvel a movimentar-se no interior da
coluna, ocorrendo o processo de partição entre a fase móvel e a
fase estacionária.

O movimento do soluto ocorre na fase móvel, sendo assim a


velocidade média de migração do soluto irá depender da
fração de tempo que o soluto permanece na fase móvel.
Técnicas Cromatográficas

Como ocorre a Eluição em coluna?


Técnicas Cromatográficas

Existe uma ordem genérica para eluição dos compostos?


Técnicas Cromatográficas

Cromatogramas
 Quando um detector responde à concentração de um soluto,
ele responde no final da coluna registrando em função do tempo,
originando-se assim uma série de picos, conhecidos como
cromatogramas.
Técnicas Cromatográficas

Velocidade de migração do soluto

Para que uma coluna cromatográfica consiga separar bem dois


solutos deve ser observada as velocidades relativas com que as
espécies são eluídas.

Para isso é necessário observar como ocorre o equilíbrio nesse


processo, o qual é dado através de equações simples.

Pode-se dizer que o equilíbrio entre a fase móvel e a fase


estacionária para um dado soluto A é expressa por:
Técnicas Cromatográficas

Velocidade de migração do soluto


Desse modo determinemos a expressão da constante de
equilíbrio (de distribuição) para as atividades do soluto
interagindo com ambas fases.
Técnicas Cromatográficas

Tempo de Retenção
A constante de distribuição não é facilmente medida, no lugar
dela é comumente utilizado o tempo de retenção.

Esse fator indica o tempo necessário para que um dado


analito seja detectado na coluna, sendo emitido em seguida o
seu sinal.
Técnicas Cromatográficas

Velocidade de migração do soluto


Fatores que interferem na
eluição cromatográfica.
Fatores que interferem na eluição cromatográfica.

ALARGAMENTO DA BANDA
A eficiência de uma coluna cromatográfica é afetada quando
ocorre um alargamento da banda, isto ocorre durante o tempo
que o composto passa na coluna.

Mas porque as bandas se tornam mais largas?

 Os picos cromatográficos seguem a forma de uma


distribuição Gaussiana ou normal.
 Nesse tipo de curva existem erros, que são a soma das
incertezas dos compostos não-detectáveis e aleatórias de um
dado composto.
 O tempo de permanência, ou seja, de contato entre a fase
estacionária e a fase móvel é extremamente irregular.
Fatores que interferem na eluição cromatográfica.

ALARGAMENTO DA BANDA
 O movimento da molécula através da coluna só ocorre
quando a molécula está em contato com a fase móvel. Desse
modo cada molécula percorrerá com uma velocidade específica.

 Portanto, a largura da banda ou de uma zona aumentará à


mediada que a molécula venha a se mover na coluna, ou seja,
de acordo com o tempo de permanência da molécula na
coluna.

Quanto menor a velocidade de transferência de massa entre


o soluto e as partículas da coluna, maior alargamento da
banda na saída da coluna.
Fatores que interferem na eluição cromatográfica.

EFEITOS DO ALARGAMENTO DA BANDA


Fatores que interferem na eluição cromatográfica.

Otimização da coluna: uma separação é otimizada quando uma


mistura é bem separada no menor tempo possível.

Variáveis que interferem no processo:

 redução do alargamento do pico;


 alteração da velocidade de migração relativa do componente.

VAZÃO DA
FASE MÓVEL
Fatores que interferem na eluição cromatográfica.

Vazão da fase móvel:

Para que se possa determinar a vazão da fase móvel, tem-se


realizado estudos em torno da determinação de H (altura de
pratos). Em torno desse estudo é possível verificar que:

• A eficiência de uma coluna cromatográfica aumenta com o


aumento do número de pratos (N), o qual é determinado pela
equação 1:

N = L /H (1)

Em que: L é o comprimento (em centímetros) do recheio da


coluna.
Fatores que interferem na eluição cromatográfica.

Vazão da fase móvel:

OBS: Os termos altura de pratos e número de pratos foram


empregados pela primeira vez por Martin e Synge que trataram
uma coluna cromatográfica como uma coluna de destilação
formada por contínuos pratos. De modo que pode-se definir H a
partir da equação 2:
H = σ2/L (2)

Em que: σ2 é a variância de uma curva Gaussiana


(formato que geralmente é apresentado pelas bandas
cromatográficas).
Fatores que interferem na eluição cromatográfica.

Outros fatores que interferem na separação cromatográfica

 Concentração da fase estacionária: é normal haver uma


diminuição da concentração da fase estacionária por arraste da
fase móvel. É por esse motivo, que existe um tempo de vida útil
para cada coluna, por exemplo.

 Temperatura: embora não seja o parâmetro mais estudado,


sabe-se que a temperatura influencia diretamente na solubilidade,
difusividade, polaridade e viscosidade da fase móvel (LANÇAS ,
2012). Contudo já é possível afirmar que:
• temperaturas elevadas levam a uma diminuição da viscosidade e
um aumento da velocidade de difusão.
Fatores que interferem na eluição cromatográfica.

CROMATOGRAFIA GASOSA
Fatores que interferem na eluição cromatográfica.
Fatores que interferem na eluição cromatográfica.

GRADIENTE DE TEMPERTAURA
Fatores que interferem na eluição cromatográfica.
Fatores que interferem na eluição cromatográfica.

Outros fatores que interferem na separação cromatográfica

Se ocorre um aumento na velocidade de difusão, aumentará


também a transferência de massa entre fase móvel e estacionária,
tornando possível DIMINUIR o tempo de análise de uma amostra.
Classificação das Técnicas Cromatográficas

Uma vez entendidos os fatores que influenciam


diretamente no sinal cromatográfico, é
importante estudarmos um pouco mais sobre
as fases estacionárias e as colunas empregadas.
Classificação das Técnicas Cromatográficas

Fase Estacionária
Classificação das Técnicas Cromatográficas

Fase Estacionária
Classificação das Técnicas Cromatográficas

FASE ESTACIONÁRIA
Necessária correta escolha para uma melhor separação e picos
bem definidos.
Classificação das Técnicas Cromatográficas

FASE ESTACIONÁRIA
Fatores que interferem na eluição cromatográfica.

FASE ESTACIONÁRIA

Características que devem ser observadas:

• Polaridade;

• Presença de aromaticidade;

• Capacidade de retenção do composto que se deseja


identificar;

• Pureza;

• Solubilidade.
Fatores que interferem na eluição cromatográfica.

FASE ESTACIONÁRIA

QUE COMPOSTO SE DESEJA


IDENTIFICAR? VOCÊ CONHECE BEM
SUAS PROPRIEDADES?
Fatores que interferem na eluição cromatográfica.

FASE ESTACIONÁRIA

Muitos compostos orgânicos possuem isômeros, que dependendo


do tipo de isomeria apresentada os tornarão difíceis de serem
identificados.

Os isômeros mais difíceis de serem identificados são os


isômeros óticos, sendo necessário trabalhar com fases
estacionárias específicas.
Fatores que interferem na eluição cromatográfica.

FASE ESTACIONÁRIA
Fatores que interferem na eluição cromatográfica.

ESCOLHA DA COLUNA EMPREGADA

Cromatografia em Coluna: uma vez escolhido o tipo de


cromatografia, deve-se passar a escolha da coluna propriamente
dita. Requer um conhecimento prévio da amostra/matriz.

Pontos a serem avaliados:


• Comprimento da coluna;
• Diâmetro interno;
• Vazão da coluna;
• Tamanho da partícula.
Fatores que interferem na eluição cromatográfica.

ESCOLHA DA COLUNA EMPREGADA


Fatores que interferem na eluição cromatográfica.

TIPO DA TÉCNICA EM COLUNA EMPREGADA

Na aula passada vimos que existem diferentes tipos de


processos de separação.
Fatores que interferem na eluição cromatográfica.

Dentre as técnicas hoje detalharemos os processos: adsorção!


Fatores que interferem na eluição cromatográfica.

Dentre as técnicas hoje detalharemos os processos: adsorção!


Fatores que interferem na eluição cromatográfica.

Dentre as técnicas hoje detalharemos os processos: adsorção!


Fatores que interferem na eluição cromatográfica.

Dentre as técnicas hoje detalharemos os processos: troca iônica


Fatores que interferem na eluição cromatográfica.

Dentre as técnicas hoje detalharemos os processos: exclusão!

Características importantes para o gel empregado:


Inércia Química (não deve haver interação entre a matriz e
o analito; Estabilidade (suportar o uso contínuo); Baixo
teor de íons.
Implantação do Método
Cromatográfico
Implantação do Método Cromatográfico

ESCOLHA DA COLUNA EMPREGADA


Condicionamento da coluna: escolha da fase móvel, da sua
vazão e do tempo de análise.
Cuidados:
• Fase móvel deve está pura,
livre de partículas e gases;
• Modo como irá ser injetada:
 Isocrático: composição
constante durante a separação;
 Gradiente: a composição é
alterada durante a separação.
• Temperatura de análise.
Implantação do Método Cromatográfico

Escolha do tipo de Cromatografia a ser empregada


Condicionamento da coluna: escolha da fase móvel, da sua
vazão e do tempo de análise.
Preparação do padrão:
• Escolha do padrão (material de referência);
• Solvente empregado (uso para cromatografia);
• Identificação da amostra;
• Construção da curva analítica: faixa de trabalho,
determinação dos limites de detecção e de quantificação);
Correta escolha dos pontos da curva (ideal 7 pontos) ---
Linearidade da curva;
• Determinação do tempo de retenção de cada componente.
Implantação do Método Cromatográfico

Determinação das condições de análise:


• Volume de injeção;
• Técnica de injeção;
• Para cromatografia gasosa ajustar a temperatura do
vaporizador.

Concentração dos componentes em análise (de interesse)


• A partir da faixa da curva verificar como realizar a etapa de
pré-tratamento da amostra.
• A matriz analisada está no mesmo solvente que o empregado
no método?
Implantação do Método Cromatográfico

Concentração dos componentes em análise (de interesse)


 Etapa de pré-tratamento da amostra
 Filtração simples;
 Filtração em membranas microporosas;
 Filtração seguida de concentração;
 Extração (analisar qual tipo empregar).

Extração em
Soxhlet

Extração
com
cartuchos
Implantação do Método Cromatográfico

Determinação da concentração dos compostos de interesse


 Método de cálculo empregado
 Valor da área do pico cromatográfico
 Equação da curva analítica (calibração).
 Método validado.
 Número mínimo de análises a ser realizada.
 Reprodutibilidade.

 Análise dos erros estatísticos


Operações envolvidas: pesagem, medição de volume,
diluição, técnicas de injeção. (Aqui um cuidado especial para
toda aparelhagem envolvida é NECESSÁRIO).
Implantação do Método Cromatográfico

Segundo Brito et al. (2003): “O desenvolvimento de um


método analítico, a adaptação ou implementação de
método conhecido, envolve processo de avaliação que
estime sua eficiência na rotina do laboratório. Esse
processo costuma ser denominado de validação”.
Validação de Métodos Analíticos

Validação: ato que consiste em dar validade, tornando legítimo;


processo que visa diminuir ou controlar os fatores que geram
precisão ou inexatidão do que está sendo avaliado/analisado.
“Avaliação sistemática de um método, de modo a
demonstrar que está sob condições de ser aplicado”.
Validação de Métodos Analíticos

Por que validar um método?

• Variabilidade dos resultados de uma amostra;


• Padronizar exigências do consumidor;
• Determinar com segurança o tempo de retenção (faixa).

O que se deve validar?

• Procedimentos ou métodos empregados no laboratório,


assegurando que estes atendam aos requisitos pré-
estabelecidos.
Validação de Métodos Analíticos

Quais critérios ou parâmetros devem ser avaliados para a


validação de um método?

• Exatidão
• Precisão
• Linearidade
• Limites de Quantificação e de Detecção
• Especificidade / Seletividade
• Estabilidade
• Robustez
• Intervalo de trabalho / aplicação
Validação de Métodos Analíticos

Antes de adentrarmos nos parâmetros mais especificamente uma


análise é válida!

Seletividade/Identificação: além de determinar corretamente o


tempo de retenção da amostra é necessário observar:
• Presença de impurezas na amostra;
• Recombinação das estruturas químicas dos conservantes,
aditivos e princípios ativos que estejam presentes na
amostra.

Importante: Se o método não for validado a determinação de


uma amostra não possui valor científico (necessária confirmação
da análise cromatográfica por outra fonte, por exemplo, a
espectrometria de massas).
Validação de Métodos Analíticos

PREPARAÇÃO DO PADRÃO
• Pesagem (se for o caso) em balanças de precisão;
• Vidrarias calibradas;
• Solventes de qualidade com grau de pureza para análise
cromatográfica.
LINEARIDADE: resposta obtida a partir de dados do analito,
que deve ter uma faixa de concentração bem determinada. Seu
estudo é realizado com base no cálculo do o coeficiente de
regressão linear (R2) para cada uma das curvas.
Deve-se observar a quantidade de pontos e o intervalo entre
eles.
A equação da reta terá a fora: y = ax + b, em que:
y é a variável dependente, x a variável independente, a o
coeficiente angular e b o coeficiente linear.
Validação de Métodos Analíticos

LINEARIDADE

Intervalo de aplicação: corresponde ao intervalo


(concentrações superior e inferior) no qual o procedimento
informa dados satisfatórios, ou seja, que atendem os parâmetros:
exatidão, linearidade e fidelidade.

Importante: Caso uma amostra a ser analisada esteja com


concentração fora deste intervalo, outro intervalo deverá ser
formulado e para tal todos os procedimentos de validação
realizados.
Validação de Métodos Analíticos

PRECISÃO: expressa a concordância entre vários resultados


analíticos obtidos para uma mesma amostra (Lanças, 2004).
Pode ser determinada de duas formas: através da
repetibilidade ou da reprodutibilidade.

Condições de repetibilidade: resultados independentes são


obtidos empregando: o mesmo método, a mesma amostra, o
mesmo laboratório, mesmo operador, mesmo equipamento e
curto intervalo de tempo.
Condições de reprodutibilidade: os resultados são obtidos
utilizando o mesmo método e amostra em diferentes laboratórios
ou diferentes operadores ou em diferente equipamentos.
Validação de Métodos Analíticos

PRECISÃO COMO MENSURÁ-LA?

Um mínimo de cinco replicatas devem ser analisadas, em


seguida deve-se medir o coeficiente de variância (CV) que está
diretamente relacionado ao desvio-padrão.

O Coeficiente de variância é também conhecido


como desvio-padrão relativo.
Validação de Métodos Analíticos

EXATIDÃO: parâmetro que expressa a concordância entre o


valor encontrado e o valor aceito como verdadeiro ou aceito
como referência.
Como determinar?
• Análise comparativa de padrões de referências certificados;
nesse caso a concentração do analito é conhecida. A dificuldade
reside nos altos valores dos materiais de referência.
• Através de comparação entre o método proposto com dados
de um método previamente validado (neste caso a precisão e a
exatidão devem ter sido determinadas).

• A partir do processo de fortificação da amostra, ou seja,


adição de uma quantidade conhecida de um padrão certificado
do analito à matriz analisada.
Validação de Métodos Analíticos

EXATIDÃO

Pode-se determinar a exatidão através da expressão:

Exatidão =

Baixos valores de exatidão são ocasionados por erros


sistemáticos (erro determinado, que é corrigido automaticamente
pelo próprio método).

O erro da exatidão é, portanto, um tipo de erro sistemático,


que pode ser avaliado pelo emprego do teste t (de Student).
Validação de Métodos Analíticos

EXATIDÃO
Teste t.

Em que:
X = é a média aritmética das n determinações;
s = desvio-padrão;
n = número de repetições;
μ = valor real.

Uma vez determinado o valor de tcalc, este deverá ser comparado


com o valor de ttab. Quando o valor de tcalc ≤ ttab para o
correspondente valor de n-1 a avaliação do método está correta.
Validação de Métodos Analíticos

EXATIDÃO
Teste t.

n-1 P 90% P 95% P 99%


1 6,314 12,076 63,657
2 2,920 4,303 9,925
3 2,3353 3,182 5,841
4 2,132 2,776 4,608
5 2,015 2,571 4,032
6 1,943 2,447 3,707
Validação de Métodos Analíticos

EXATIDÃO: uma das maneiras de mensurar a exatidão de um


método é através da recuperação, que pode ser estudada como
um dos parâmetros para validação de um método.
Recuperação: trata da medida da eficiência de um processo de
isolamento do analito que se encontra na matriz analisada.

Pode ser expressa da seguinte maneira:

Valores entre 70% e 120% são aceitos como boas


recuperações.
Validação de Métodos Analíticos

LIMITE DE DETECÇÃO (LD) E LIMITE DE


QUANTIFICAÇÃO (LQ)
LD = Expressa a menor quantidade de analito capaz de ser
detectada, mas não necessariamente quantificada com exatidão.
LQ = Expressa a menor quantidade de um analito que pode ser
quantificada com exatidão e com fidelidade determinada.

Existem diferentes formas de distinguir um ruído de um


sinal analítico, a forma mais empregada é aceitar o LD, que
pode ser determinado pela equação a seguir.

Sendo:
S = Valor da inclinação da curva analítica, s = desvio-padrão
Validação de Métodos Analíticos

SELETIVIDADE
Segundo Lanças, “a seletividade corresponde à capacidade de
um método em determinar de maneira inequívoca na presença
de outras substâncias de interferirem na determinação”.
Este parâmetro é de extrema importância quando se trata de
amostras complexas.
Alguns autores usam o termo especificidade, cabendo aqui
uma análise sobre os termos:
• Específico: método capaz de produzir a resposta para um
único analito;
• Seletivo: método capaz de fornecer uma resposta para um
grupo de entidades químicas que podem ser distinguíveis umas
das outras.
Validação de Métodos Analíticos

ROBUSTEZ
Este parâmetro trata da medida da capacidade de um método de
não sofrer alterações em decorrência de possíveis variações que
possam ocorrer durante a aplicação de um método.
 Nem todos os procedimentos de validação exigem a
determinação deste parâmetro.
 Por que incluí-lo? Este parâmetro permite medir a
confiabilidade do método em condições normais de operação
auxiliando quando:

o Mudança das propriedades de uma coluna cromatográfica;


o Mudança da coluna empregada.
Validação de Métodos Analíticos

ROBUSTEZ

Observada alteração do fator resposta, pode-se sugerir um


planejamento fatorial para análise da influência dos parâmetros
que interferem na coluna cromatográfica, por exemplo.

o Temperatura da coluna;
o Fluxo da fase móvel;
o Composição da fase móvel.

Como verificar a robustez de uma coluna?

• Determinando a seletividade pelo menos 3 colunas fornecidas


pelo mesmo fabricante.
Universidade Federal de Pernambuco
Centro de Tecnologia e Geociências
Departamento de Engenharia Química

Fase Estacionária e Fase Móvel

Colunas e Suportes

Prof. Daniella Carla Napoleão

DEQ/UFPE
A fase estacionária possui conceitos previamente estabelecidos,
ou seja, se essa fase for mais polar que a fase móvel ela é
chamada de fase normal. Se a fase estacionária for mais apolar
que a fase móvel é chamada de fase reversa (fase estacionária
quimicamente ligada).

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CROMATOGRAFIA
CLÁSSICA

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FASE ESTACIONÁRIA

Divide-se basicamente em:


1- sólidas,
2- líquidas,
3- quimicamente ligadas.

 Quando a fase estacionária se tratar de um líquido, este pode


estar simplesmente adsorvido sobre um suporte sólido ou
imobilizado sobre ele. Suportes modificados são considerados
separadamente, como fases quimicamente ligadas, por
normalmente diferirem dos outros dois em seus mecanismos de
separação.

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FASE ESTACIONÁRIA

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA CLÁSSICA: Os adsorventes


possuem partículas na faixa de 60-230 mesh, de modo a
possibilitar um fluxo razoável do solvente através da coluna. O
uso de sílica de partícula menor (230-400 mesh) como
adsorvente para essas colunas requer a utilização de um sistema
de bombeamento para o empacotamento e eluição, sendo
conhecido como Cromatografia Flash.

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FASE ESTACIONÁRIA

Importante:

O uso de fases estacionárias líquidas


adsorvidas a um suporte não tem grande
aplicação devido à perda de fase estacionária!

O uso de suportes modificados, os quais foram 
desenvolvidos como consequência do problema 
acima, possibilita a produção de uma imensa 
variedade de colunas. As fases assim obtidas são 
chamadas de quimicamente ligadas.
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FASE FASE
ESTACIONÁRIA ESTACIONÁRIA
SÓLIDA LÍQUIDA

ADSORÇÃO PARTIÇÃO

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Cromatografia Gasosa e Fases Estacionárias Líquidas

Propriedades desejáveis quando se emprega cromatografia gás-


líquido:

1.Baixa volatilidade --- o ponto de ebulição do líquido deve ser


pelo menos 100ºC maior que a temperatura máxima de operação
da coluna;
2.Estabilidade térmica;
3.Inércia química;
4.Características de solvente apropriadas para que os valores de
k e α para os solutos caiam dentro de uma faixa adequada.

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Cromatografia Gasosa e Fases Estacionárias Líquidas

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Cromatografia Gasosa e Fases Estacionárias Líquidas

Embora vários líquidos tenham sido propostos como fases


estacionárias no desenvolvimento da cromatografia gás-líquido,
apenas uma dezena é comumente empregada.

LEMBRE QUE A ESCOLHA CORRETA DA FASE


ESTACIONÁRIA É FUNDAMENTAL PARA O SUCESSO
DA SEPARAÇÃO!

Para que um analito permaneça tempo razoável em


contato com a fase estacionária ele precisa ter um grau de
compatibilidade (solubilidade) com a fase estacionária.
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Cuidados necessários com Fase a estacionária

Fluxos altos resultam em:


– Destruição do suporte do recheio (velocidade = moagem,
quebra)
– Pressão de trabalho alta e choques de pressão que poderão
promover: degradação do leito desgaste dos selos da bomba
e do injetor. Causas de pressão elevada: coluna 
suja;  bloqueios  (pré-coluna,  filtro,  fluxo 
do  detector,  sistema  de  filtro);  solvente 
muito viscoso.
Causas de pressão muito baixa:
vazamentos,  mal  funcionamento  da 
bomba, excesso de ar, fluxo.

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Escolha da fase móvel em Cromatografia Gasosa: gás de
arraste)

Fatores importantes:
- Disponibilidade/custo.
- Eficiência na separação.
- Efeito sobre o tempo de análise.
- Segurança.
-Efeito sobre o sistema
de detecção

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Escolha da fase móvel em Cromatografia Líquida

Em Cromatografia Líquida empregam-se como Fase


Móvel principalmente água deionizada, metanol,
acetonitrila.
ALGUNS CUIDADOS SÃO IMPORTANTES AO
TRABALHAR EM CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE
ALTA EFICIÊNCIA, POIS CERCA DE 50% DOS
PROBLEMAS DE ANÁLISE TEM ORIGEM NA FASE
MÓVEL

DIAGNÓSTICO LENTO!

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Escolha da fase móvel em Cromatografia Líquida

Onde estão os problemas com a fase móvel?

ISSO ESTÁ CORRETO?

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Escolha da fase móvel em Cromatografia Líquida

Quando a fase móvel é água alguns cuidados a mais são


necessários, não sendo adequado empregar:

– Água mono-destilada: contaminação de orgânicos voláteis;


– Água deionizada comum: contaminação alta de orgânicos
devida à resina aromática;
– Água de osmose reversa: presença de íons e orgânicos de baixo
peso molecular;
– Água de osmose reversa + eletro-deionização: orgânicos de
baixo peso molecular.

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Escolha da fase móvel em Cromatografia Líquida

Como deve está a água? Que condições?

•Água deve ser grau HPLC (Milli-Q)


•Usar água destilada ou osmose reversa para alimentar o sistema
Milli-Q
•Livre de bactérias (esterilizada por membrana 0,22 μm)
•Resistividade >> 18 megohm (< 1ppb de íons) “Resistividade
indica somente o teor de íons”
•Teor de orgânicos < 20 ppb para análises normais.

FILTRAÇÃO

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Escolha da fase móvel em Cromatografia Líquida

Como preparar a fase móvel?

O correto é preparar diariamente a fase móvel!

Deve ser verificada se há formação de precipitado e


verificar o pH da solução antes da injeção desta no
equipamento.

Em caso de ser formada por mais de um componente medi-los


separadamente e depois misturar, antes da filtração.
Importante: Não juntar um componente com outro,
“avolumando” para o volume final.

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Fase móvel - CUIDADOS

Cuidados adicionais: quando houver presença de gases como O2


e N2 é necessária uma desgaseificação, pois a presença destes
gases poderá interferir na reprodutibilidade do fluxo e na
estabilidade da linha de base.

O QUE FAZER?
•Vácuo
•Ultra-som
•Vácuo + ultra-som
•Purga com gás Hélio
•Escolha correta da velocidade do fluxo e da pressão de
operação

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Constituição da coluna: aço inox 316, alumínio, níquel, vidro ou
teflon. Quando não se conhece bem o material o ideal é empregar
colunas de vidro.

Classificação das colunas quanto ao diâmetro externo:


- Coluna microanalítica (capilar) ......... 0,05 a 0,54 mm
- Coluna analítica .................................. 1/8”, 3/16” e 1/4”
- Coluna semipreparativa ..................... 3/8”, 1/2” e 5/8”
- Coluna preparativa .............................. 5, 7 e 10 cm

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COLUNAS CROMATOGRÁFICAS

• Colunas analíticas possuem de 2 a 3 m de comprimento, com


cerca de1.000 a10.000 pratos teóricos.
• Colunas capilares são bem mais longas. As primeiras capilares
fabricadas possuíam mais de 100 m e cerca de 100.000 pratos
teóricos.
As colunas capilares recebem denominações diferentes, em função
do diâmetro interno:
Microbore: 0,05 mm e 0,10 mm;
Minibore: 0,18 mm;
Midibore: 0,25 mm e 0,32 mm;
Megabore: 0,45 mm e 0,53 mm.

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IMPORTANTE: As colunas em cromatografia líquida
são sempre retas!
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COLUNAS PARA CLAE

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COLUNAS PARA CLAE

Influência do tempo de retenção: este depende da


temperatura, sendo assim as colunas devem ser mantidas
termostatizadas em um forno onde pode-se selecionar a
temperatura apropriada para a separação.

Redução do custo dos solventes e aumento da eficiência:


emprego de colunas com diâmetro interno de 1 – 3 mm, de
forma que se possa operar com fluxos menores resultando na
diminuição do custo operacional.

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COLUNAS PARA CLAE

1.  Há contaminação da coluna?
2. Onde ocorre? Entrada do leito.

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O QUE A CONTAMINAÇÃO PODE CAUSAR?

O processo de "retenção irreversível", ou seja, a afinidade do


contaminante pela coluna é tão grande que ele não elui, ficando
retido nos primeiros centímetros do empacotamento, o que pode
acarretar:

• Perda da eficiência,
• Aumento de pressão,
• Cauda nos picos

“ Ao perceber os sintomas de contaminação (os mais comuns


são aumento de pressão e elevação no nível de ruído), o
analista deve substituir a pré-coluna, que em média custa 10
vezes menos que a coluna analítica”.
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O QUE A CONTAMINAÇÃO PODE CAUSAR?

Como realizar a limpeza da coluna?

Solventes eficientes para limpeza devem: dissolvem bem a


sujeira, sem dissolver o recheio da coluna;

 Pontos negativos:
– Precipitação dos contaminantes / tampões
– Desnaturação de proteínas
– Remoção parcial da fase química ligada (hidrólise)

• É melhor empregar técnicas preventivas como SPE


(extração em fase sólida) para limpar a amostra antes de
injetar.
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O uso de pré-colunas é de importância vital para a vida útil
da coluna analítica. A filtração da fase móvel e da amostra
nem sempre são suficientes para a eliminação de impurezas
prejudiciais à coluna.

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Cromatografia Líquida de Alta Eficiência –CLAE

Tipos de pré-coluna: são basicamente usados dois tipo de pré-


coluna.
1.Coluna scavenger: colocada entre o reservatório da fase
móvel e o injetor é usada para o condicionamento da fase
móvel. Nesse caso, o solvente dissolve parcialmente o
empacotamento da sílica e garante que a fase móvel seja
saturada com ácido sílico antes de entrar na coluna analítica.

2.Coluna de guarda: posicionada entre o injetor e a coluna


analítica, trata-se de uma coluna curta empacotada com uma
fase estacionária similar à fase estacionária da coluna
analítica.Tem como objetivo prevenir que impurezas atinjam e
contaminem a coluna analítica.
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COLUNAS PARA CROMATOGRAFIA GASOSA

Tipos: colunas empacotadas e colunas capilares.

A coluna fica abrigada em um forno termostatizado e sua


temperatura ótima depende do ponto de ebulição da
amostra e do grau de separação requerido.

Em resumo, uma temperatura igual ou ligeiramente


superior ao ponto de ebulição médio da amostra leva uma
boa eluição em tempos razoáveis.

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COLUNAS PARA CROMATOGRAFIA GASOSA

Colunas capilares: é comum encontrar colunas revestidas


com uma fina camada da fase estacionária liquida. Existem 2
tipos:

• coluna tubular aberta de parede revestida (TAPR);


• coluna tubular aberta revestida com suporte (TARS).

Geralmente, a eficiência de uma coluna do tipo TARS é


menor que a de uma coluna do tipo TAPR. Porém ambas,
são mais eficientes que as colunas empacotadas.

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COLUNAS PARA CROMATOGRAFIA GASOSA
As primeiras colunas TAPR foram construídas com aço
inoxidável, alumínio, cobre ou plástico, verificava-se
entretanto, um processo de corrosão no vidro de borossilicato
em presença de ácido clorídrico gasoso.

A partir dessa observação colunas capilares de sílica


fundida começaram a ser empregadas, que contém sílica
purificada e quantidades mínimas de óxidos metálicos.
São atualmente as colunas mais utilizadas em cromatografia
gasosa, pois possuem maior resistência física, reatividade
mais baixa diante dos componentes da amostra e
flexibilidade.
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COLUNAS PARA CROMATOGRAFIA GASOSA
Colunas empacotadas: as mais modernas são fabricadas a
partir de tubos de vidro ou de metal. Os tubos são densamente
empacotados com material uniforme e finamente dividido, ou
suporte sólido , que é recoberto com uma fina camada da fase
estacionária líquida.
Materiais Sólidos de Suporte: serve para fixar fase
estacionária líquida de forma que a maior área superficial
possível esteja exposta à fase móvel.
Os materiais de suporte são quimicamente tratados com
dimetilclorosilano, que produz uma camada de grupos metila,
reduzindo a tendência do empacotamento absorver moléculas
polares.
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Tipo de VANTAGENS DESVANTAGENS
Coluna
Empacotadas Mais econômica; Maior Menor eficiência,
Capacidade de carga; análise mais lenta.
Maior quantidade de Cuidado com o
amostra. enchimento da
coluna para não
causar diluição da
amostra

Capilares Maior comprimento, o Capacidade de


que leva a uma maior processamento da
eficiência; Separação de amostra inferior;
misturas complexas; Menor quantidade
Análise mais rápida; de amostra .
Maior separação.

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CUIDADO IMPORTANTE COM COLUNAS CAPILARES

CUIDADOS EM GERAL

Evitar mudanças drásticas de fluxo e tipos de solventes;


Não expor as colunas a temperaturas maiores que 60°C;
 Evitar colisões e quedas das colunas;
Não submeta a coluna a pH extremos se não for estritamente
necessário;
 Nunca armazene ou estoque a coluna em soluções tamponadas;
 Utilize somente solventes grau HPLC.

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CONSIDERAÇÕES IMPORTANTES EM TORNOS DE COLUNAS
CROMATOGRÁFICAS

Eventualmente todas as colunas perdem o desempenho e devem


ser substituídas. O tempo depende das condições cromatográficas
usadas, bem como da própria coluna.

 Necessário monitoramento o desempenho da coluna pode-se


saber se ela iniciou a se deteriorar e prever quando deve ser
substituída.

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Processo de injeção da amostra
Cromatografia Gasosa

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Processo de injeção da amostra
Cromatografia Gasosa

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Processo de injeção da amostra
Cromatografia Gasosa

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Processo de injeção da amostra
Cromatografia Gasosa

Parâmetros de Injeção

•Temperatura do Injetor: precisa ser suficientemente elevada


para que a amostra não sofra vaporização antes da análise.
•O IDEAL é que a temperatura de injeção seja superior a 50ºC
da temperatura de ebulição do componente menos volátil.
•Volume injetado: VARIÁVEL.

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Processo de injeção da amostra
Cromatografia Gasosa

Parâmetros de Injeção

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Processo de injeção da amostra
Cromatografia Líquida

CUIDADO: Sempre que possível dissolver a amostra na Fase Móvel ou em 
solventes mais fraco. 

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Processo de injeção da amostra
QUESTIONAMENTOS NECESSÁRIOS

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Universidade Federal de Pernambuco
Centro de Tecnologia e Geociências
Departamento de Engenharia Química

Sistemas de Detecção: teoria, 
características e aplicações.

Prof. Daniella Carla Napoleão

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DEFINIÇÃO DE DETECTOR: é um dispositivo conectado
na saída da coluna que percebe a presença de
componentes e emite um sinal elétrico a ser registrado na
forma de um pico cuja área é proporcional a quantidade
do componente analisado.
 São classificados em 3 tipos:
Universais – geram um sinal para qualquer composto.
Seletivos – geram um sinal apenas para compostos com
determinadas características.
Específicos – geram um sinal para compostos que tenham
um determinado elemento na sua estrutura.
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Vários detectores têm sido estudados para aplicação em vários
modos cromatográficos:
•Espectrometria de massas(MS),
•Espectrometria de infravermelho com transformada de Fourier
(FT-IR),
•Detecção de absorção (UV),
•Detecção de ionização de chama (FID),
•Detector termoiônico (TID),
•Detector fotométrico de chama (FPD),
entre outros.

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CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA

É utilizada em análises de compostos não voláteis ou


instáveis termicamente onde a cromatografia a gás não
pode ser utilizada. Como cerca de 80% dos compostos
apresentam essas características, o campo de aplicação de
HPLC é extremamente vasto.

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CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA
Características de um Detector Ideal:
a)Alta sensibilidade e baixo limite de detecção;
b) Resposta rápida a todos os solutos;
c) Insensibilidade a mudanças nas temperatura e na vazão da fase
móvel;
d) Resposta independente da fase móvel;
e) Pequena contribuição ao alargamento do pico pelo volume extra
da cela do detector;
f) Resposta que aumente linearmente com a quantidade do soluto;
g) Não destruição do soluto;
h) Segurança e conveniência de uso;
i) Informação qualitativa do pico desejado.
Infelizmente, não existe um detector que apresente todas
estas propriedades, a não ser que ele seja desenvolvido.

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CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA

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CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA

Detectores de índice de refração:

No momento da passagem do analito pelo detector, pode


ocorrer uma alteração do índice de refração. Essa alteração em
relação ao valor da fase móvel livre de analito é detectada. A
detecção só é possível quando o índice de refração do
analito é diferente do IR da fase móvel.

Desvantagens: baixa sensibilidade, não permite a


utilização em análises por gradiente (pois o IR varia com
a composição da fase móvel), temperatura deve ser
constante (pois o IR varia com a temperatura).
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CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA

Detectores de espectrofotômetro UV-Visível (UV-VIS)

Baseia-se na absorbância da luz pelo analito ao passar


pelo detector. É um detector seletivo pois só detecta os
compostos que absorvem no comprimento de onda em
que o detector for ajustado. É o mais utilizado em HPLC.

Considerações Importantes: A fase móvel utilizada não


pode absorver no comprimento de onda selecionado, a
pureza da fase móvel é extremamente importante (GRAU
HPLC).
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CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA

Detectores de espectrofotômetro UV-Visível (UV-VIS)

Podem ser de dois tipos: Fotométricos – comprimento de


onda fixo (254nm e 280nm ) e Espectrofotométricos –
comprimento de onda variável.

MAIS SENSÍVEL
E MAIS SELETIVO

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CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA
Detectores de espectrofotômetro UV-Visível (UV-VIS)

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CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA
Detectores de Fluorescência

•A espectroscopia de fluorescência é um método de detecção dos


mais sensíveis específico para compostos que fluorescem.

•Em boas condições é possível detectar quantidades da ordem de


picogramas (10-12 g), o que é comparável aos detectores por captura
de elétrons em CG.

•A fase móvel empregada nos detectores de fluorescência deve ser


cuidadosamente selecionada, pois a intensidade de emissão
depende do meio em que se encontra a amostra.

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CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA
Detectores de Fluorescência

•Uma fonte de UV é necessária em ambos os detectores, por


absorbância no UV e por fluorescência, eles podem ser combinados
em um só detector.

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CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA
Detectores de Fluorescência

•Exemplo de um cromatograma

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CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA
Detectores Eletroquímicos

Baseia-se na possibilidade de muitos compostos serem


oxidados ou reduzidos quando se aplica um potencial elétrico.
Eles oferecem vantagens de alta seletividade, alta
sensibilidade e serem muito bons para as análises de traços

 A corrente gerada é proporcional a concentração do


composto.
 A amostra tem que ser constituída de íons ou
compostos que sofram ou oxidação ou redução.

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CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA

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CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA

Ruídos provenientes do Detector

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CROMATOGRAFIA GASOSA

É uma técnica consolidada para a análise de misturas que


contêm compostos voláteis e semivoláteis, embora seu
emprego seja visto nas mais diferentes áreas como:
petroquímica, fragrâncias, farmacêutica e ambiental.

O sistema de detecção deve responder aos analitos


previamente separados na coluna cromatográfica e que
chegam ao detector como bandas discretas em fase
gasosa.

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CROMATOGRAFIA GASOSA

Classificação geral dos detectores:


(i)seletivos ou universais, caso responda para poucos ou
para muitos analitos diferentes;
(ii)destrutivos ou não-destrutivos, se a integridade do
analito é mantida ou não durante a detecção;
(iii)sensíveis à concentração ou ao fluxo de massa, se o
detector fornece uma resposta proporcional à
concentração do analito naquela banda discreta

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CROMATOGRAFIA GASOSA

CARACTERÍSTICAS DE UM DETECTOR IDEAL

1.Detectar pequenas quantidades,


2.Fornecer resposta linear aos analitos em várias ordens
de grandeza,
3.Apresentar estabilidade e reprodutibilidade, ter
sensibilidade adequada,
4.Operar em temperaturas de ambiente até 400 °C,
5.Ser de fácil operação,
6.Apresentar tempo de resposta curto.

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CROMATOGRAFIA GASOSA

CARACTERÍSTICAS DE UM DETECTOR IDEAL

A frequência de aquisição de um detector (ou taxa de


aquisição) deve ser grande o suficiente para que o número
de registros ao longo do pico seja suficiente para
representá-lo adequadamente.

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CROMATOGRAFIA GASOSA

TIPOS DE DETECTORES

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CROMATOGRAFIA GASOSA

TIPOS DE DETECTORES
Detector de Ionização de Chama (FID): Apresenta grande
aplicabilidade, alta sensibilidade, estabilidade e uma excepcional resposta
linear. Os íons são gerados pela combustão de compostos orgânicos na
chama. Não é uma queima que gere dióxido de carbono e água, mas uma
ionização propiciada pela alta temperatura da chama de hidrogênio.

Detector de Condutividade Térmica (TCD) : O funcionamento está


baseado no princípio de que o corpo quente perde calor a uma velocidade
que depende da composição dos gases que o rodeiam. A perda de calor
pode então ser usada como uma medida da composição do gás. Nesses
detectores, o corpo quente é um filamento de um metal (Pt, W, Ni, etc),
encerrado dentro de um bloco metálico.
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CROMATOGRAFIA GASOSA

TIPOS DE DETECTORES
Detector de Condutividade Térmica (TCD) : Nesse detector o gás a ser
analisado passa através do filamento, o qual é aquecido por uma corrente
elétrica constante. A velocidade das moléculas que batem no filamento é
função do peso molecular e, como resultado, quanto menor a molécula,
maior a sua velocidade e mais alta será sua condutividade térmica.

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CROMATOGRAFIA GASOSA

TIPOS DE DETECTORES
Detector de Captura Eletrônica (ECD) : Trata-se de um dos detectores
mais populares devido a sua alta sensibilidade e utilidade para análise de
uma grande quantidade de compostos com atividade tóxica e biológica. É
muito utilizado para análise de traços de pesticidas, herbicidas, poluentes
gerados por processos químicos industriais, drogas e outros compostos
biologicamente ativos em fluídos biológicos. O princípio de detecção
usado é o decaimento de isótopos radioativos que produzem partículas
beta. Tais partículas colidem com as moléculas do gás de arraste
produzindo elétrons que formam uma corrente chamada de corrente de
fundo.

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CROMATOGRAFIA GASOSA

TIPOS DE DETECTORES
Detector de Captura Eletrônica (ECD)

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CROMATOGRAFIA GASOSA

TIPOS DE DETECTORES
Detector Fotométrico de Chama (FPD) : Este detector é usado para
compostos fosforados e sulfurados, e atua através da medida do espectro
de emissão de luz, emitida por estes compostos quando queimados em
chama rica de hidrogênio. Essas espécies quemiluminescentes emitam luz
a comprimentos de onda característicos para cada elemento. Quando
espécies contendo fósforo ou enxofre entram na chama, a emissão ocorre
e a luz é transmitida através de um filtro (que seleciona o espectro de
emissão a ser medido) para um fotomultiplicador.

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CROMATOGRAFIA GASOSA

TIPOS DE DETECTORES
Detector Termoiônico (TSD): O TSD é um detector de ionização onde,
pela adição de um sal de metal alcalino (o rubídio) na chama, observa-se
um incremento na resposta do detector para certos elementos, tais como
fósforo, nitrogênio, enxofre, boro, como também para alguns metais, por
exemplo, estanho, antimônio, arsênio e chumbo. A seletividade da
resposta do detector é dependente da chama, da temperatura e da
composição do sal. Medidas precisas dos gases da chama são essenciais
para a sensibilidade do detector. Esse detector é muito utilizado em
análises ambientais e biomédicas para detecção de resíduos de pesticidas
e drogas, onde alta sensibilidade e seletividade são parâmetros
necessários.

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CROMATOGRAFIA GASOSA

TIPOS DE DETECTORES
Detector Termoiônico (TSD)

DEQ/UFPE
CROMATOGRAFIA GASOSA

TIPOS DE DETECTORES
Detector Termoiônico (TSD): é uma técnica utilizada para analisar uma
grande variedade de hidrocarbonetos aromáticos e outros compostos
orgânicos. Uma aplicação típica é a análise de contaminação da água por
hidrocarbonetos. O PID utiliza luz ultravioleta para ionizar os
componentes que saem da coluna. Os íons são coletados por eletrodos e a
corrente gerada mede a concentração.

DEQ/UFPE
Universidade Federal de Pernambuco
Centro de Tecnologia e Geociências
Departamento de Engenharia Química

Espectometria de massas em 
cromatografia

Modos de Injeção em cromatografia 
gasosa
Prof. Daniella Carla Napoleão

DEQ/UFPE
Cromatógrafo a Gás acoplado a um
Espectrômetro de Massa

GC

MS

DEQ/UFPE
Cromatógrafo a Gás acoplado a um
Espectrômetro de Massa

Espectrômetro de Cromatógrafo a Gás


Massa

Identificação Separação

GC é a entrada da amostra para MS


ou
MS é um detector GC

DEQ/UFPE
Construção do GC-MS 

Espectrômetro de Massa GC INJ Amostra

Detector Fonte Interface


Analisador de íons
Coluna

Sistema de Vácuo
Forno

(Helio)
Controle do Instrumento
Aquisição de dados
Processamento de dados
Armazenamento de dados

Analista DEQ/UFPE
GC-MS 

No espectrômetro de massas a molécula é identificada a partir do


processo de ionização, em que se verifica o íon através da sua massa
(m) e da sua carga (z).

Dois modos de ionização são possíveis:


+
Íon
positivo

- Íon
negativo

DEQ/UFPE
GC-MS 
Como se dá o processo de ionização no MS?

Ocorre uma geração de um feixe intenso, em que são contados íons


característicos das moléculas não dissociadas e dos processos de
fragmentação relacionado à estrutura:

Impacto de elétrons (IE), Ionização química (IQ), Ionização por


dessorção química (DCI), Ionização por campo/dessorção por
campo (FI/FD), Espectrometria de massas de íons secundários
(SIMS), Bombardeamento por átomos rápidos (FAB), Dessorção
por plasma (PD), Dessorção por laser (LD), Termospray (TSI),
Electronspray (ESI), Ionização à pressão atmosférica (API),
Espectrometria de massas por neutralização - reionização (NRMS).
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GC-MS 
Fragmentação e espectro

DEQ/UFPE
GC-MS: Fragmentação

Metano:

CH4+
CH3+

CH2+
CH+

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Exemplo de Ionização e fragmentação

Ionização e fragmentação de acetona

e-
(CH3)2CO [(CH3)2CO]+ [(CH3)CO]+ CH3
MW = 58 m/z = 58 m/z = 43 m = 15
Molécula Neutra Íon Molecular
Íon de Fragmento
m= massa do íon fragmento Neutro
z= carga do ion

DEQ/UFPE
GC-MS: Fragmentação
Ionização Química Positiva

e- CH4 CH4+ CH4 C2H3+


Elétrons CH4 CH4 CH3+ CH5+
de alta
CH4 CH2+
C2H5+C2H5
+
energia Íons
Íons 
reagentes
Gás reagentes 
secundários
reagente primários
+
Reação de MH+ M Analitos
Protonação
(ion pseudo-
molecular)
C2H4

DEQ/UFPE
GC-MS: Fragmentação
Ionização Química Negativa

Analitos
Elétrons de Captura de
baixa energia - Ressonância
e -
CH4
MX MX Associativa
Elétron
e -
MX
CH4 MX
de alta  CH4
energia CH4
H - Captura de
Gás reagente CH4+ CH3+ M + X ressonância
Dissociativa

DEQ/UFPE
Sinal ou Ruído?

Ruído

Sinal

DEQ/UFPE
Precaução Geral para Manutenção em GC/MS

1. Ferramentas ou luvas sujas podem causar ruído no


background/interferência;
2. Ao trabalhar com a caixa de fonte de íons ou no interior do espectrômetro
de massa, use luvas limpas (não de plásticos ou de borracha);
3. Limpe todas as ferramentas que serão utilizadas no interior do MS com
pano livre de fiapos e acetona;
4. Quando peças forem removidas, coloque-as em cima de um pano limpo
(toalha de papel) e assegure-se de que continuarão limpas;
5. Use somente ferramentas limpas para desmontar e montar qualquer peças.
6. Anote cuidadosamente como as peças foram montadas para que assim possa ser
remontado corretamente.
7. Verifique ou substitua se necessário o Septo – use de alto desempenho e veja o
limite de temperatura (Parte do Injetor).

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Condicionamento da Coluna: cuidados gerais

• Tratamento para remover impurezas da fase estacionária da


coluna;
• Previne linha de base instável e contaminação do detector
• Conecte a coluna no injetor mas não ao detector;
• Com a coluna a temperatura ambiente, deixe fluir o gás de
arraste através da coluna por 15 a 20 minutos para remover ar;
• Aumente a temperatura da coluna a 10 ºC/min até a temperatura
máxima que a fase estacionária pode ser usada;
• Deixe a coluna a temperatura elevada por 2 horas (para colunas
capilares) e várias horas para colunas empacotadas.

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GC/MS
Exemplo de uma descrição de metodologia para análise de biodiesel

DEQ/UFPE
GC/MS
Exemplo de uma descrição de metodologia para análise de biodiesel

DEQ/UFPE
GC/MS
Exemplo de uma descrição de metodologia para análise de biodiesel

DEQ/UFPE
Cromatogramas

DEQ/UFPE
Cromatogramas

DEQ/UFPE
Cromatogramas

DEQ/UFPE
Cromatogramas em Massa
Recebe o nome de cromatograma em massa, aquele que é constituído
de todos os íons produzidos pelo espectrômetro de massas ou apenas
pelos íons de interesse produzidos por este. Comumente chamado de
“cromatograma de íons totais”.

Cromatograma e espectro
EM-EM de uma amostra
real de pimenta
contendo 0,05 mg kg-1 de
metalaxil e o espectro EM-
EM de referência do
metalaxil.
(Chiaradia et al., 2008)

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Cromatogramas em Massa

Cromatograma de corrente total de íons obtida por CL-EM-EM para um padrão


aplicado sobre o branco da matriz, a uma concentração de 250 ng g-1. As barras
verticais delimitam as JTR. Os símbolos dcd, penG, penV, ox, clox e diclox indicam,
respectivamente, desfuroilseftiofur cisteína dissulfeto, penicilina G, penicilina V,
oxacilina, cloxacilina e dicloxacilina.

DEQ/UFPE
Tipos de Analisadores de Massa
Quadrupolo

•Recebe esse nome por ser constituído por 4 hastes.

Em um valor
específico de
voltagem, íons de
uma determinada
razão m/z

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Tipos de Analisadores de Massa
Analisador de tempo de vôo (“Time-of-Flight Analiser”) -
ATV.
“Baseiam-se no princípio de que, como os íons são gerados na
mesma fonte de ionização do espectrômetro de massas, eles
possuem a mesma energia cinética, de maneira que as suas
velocidades serão apenas diferenciadas pelas suas massas”.
(Chiaradia et al., 2008)

DEQ/UFPE
Tipos de Analisadores de Massa
Ion-trap
“ O ion-trap é um quadrupolo tridimensional que “captura” todos
os íons que são introduzidos em seu interior e os mantêm
“aprisionados” até que uma determinada radiofrequência seja
aplicada e torna os íons de certa razão m/z instáveis, de forma que
são libertados do trap”. (Chiaradia et al., 2008)

O “ion trap” é um dos mais


populares analisadores de
massa, pois apresenta um
baixo custo, além de ser
pequeno, requisitando
dessa forma pouco espaço. 

DEQ/UFPE
MODOS DE INJEÇÃO EM CROMATOGRAFIA GASOSA

Injetor Split/Splitless

Fonte: SINC
DEQ/UFPE
MODOS DE INJEÇÃO EM CROMATOGRAFIA GASOSA

Injeção Split

Fonte: SINC
DEQ/UFPE
MODOS DE INJEÇÃO EM CROMATOGRAFIA GASOSA

Injeção Splitless

Fonte: SINC
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LC/MS
Considerações Gerais:
•Apresenta vantagens sobre a cromatografia com fase gasosa pois
os compostos não precisam ser vaporizados para a análise,
necessita-se menos pré-tratamento da amostra e tem maior grau de
seletividade;
•A limitação está na ausência de um detector universal como o
detector por ionização com chama na CG;
•A EM gera especificidade, seletividade e sensibilidade e
informação estrutural na análise de compostos orgânicos;
•A faixa de técnicas de ionização e a faixa de massa analisável,
permite a análise de um grande número de compostos orgânicos,
permitindo análise quali e quantitativa.

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LC/MS

Fluxo 
contínuo 
Nebulizador 
Feixe de partícula  aquecido 
Acoplamento  Acoplamento com 
via correia  (“particle beam”)  nebulizador aquecido Acoplamento e 
ionização por 
móvel
nebulização em um 
campo elétrico

DEQ/UFPE
LC/MS

TIPOS DE INTERFACE

1.Interface de primeira geração como a de correia móvel se


procura contornar a aparente incompatibilidade entre a introdução
de um líquido em um alto vácuo pela remoção do líquido.
2.Interface de segunda geração, métodos de ionização brandas
foram acoplados com a introdução dos líquidos, por exemplo: CF-
FAB.
3.Sistema CL/EM de terceira geração, o interfaceamento e a
ionização emergem como uma técnica combinada. O método de
interfaceamento é simultaneamente uma técnica de ionização,
como no caso do termospray e electrospray.

DEQ/UFPE
LC/MS

DEQ/UFPE
LC-MS- IT/TOF
HPLC

LC/MS-MS IT-TOF

DEQ/UFPE
LC-MS- IT/TOF
Exemplo de uma descrição de metodologia para detecção de fármacos
Empregou-se uma coluna do tipo ODS apresentando 50 mm
(comprimento) x 2 mm (diâmetro interno) x 3µm (espessura da fase
estacionária). A fase móvel utilizada foi composta de metanol e acetato de
amônio 2 mol.L-1, com fluxo de 0,2 mL.min-1. A temperatura do forno foi
mantida entre 40ºC e 85ºC; a fonte de ionização usada foi de Electrospray
e o intervalo de massas analisado foi de 100 a 400.

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Universidade Federal de Pernambuco
Centro de Tecnologia e Geociências
Departamento de Engenharia Química

PREPARAÇÃO DA AMOSTRA

Prof. Daniella Carla Napoleão

DEQ/UFPE
PREPARAÇÃO DA AMOSTRA

 O QUE É ESSENCIAL PARA QUE UM MÉTODO ANALÍTICO FUNCIONE 
BEM?
•Boa amostragem,
•Preparação,
•Solubilização da amostra para análise.

DEQ/UFPE
PREPARAÇÃO DA AMOSTRA

DEQ/UFPE
PREPARAÇÃO DA AMOSTRA

QUE TIPO DE CROMATOGRAFIA SERÁ EMPREGADA? 

DEQ/UFPE
PREPARAÇÃO DA AMOSTRA

A  preparação  da  amostra  é  a  série  de  etapas  necessárias  para 


transformarmos  uma  amostra,  de  tal  forma  que  ela  se  torne  apropriada  para 
análise. 

A etapa de preparo de amostra é cara e envolve consumo de tempo esforço. O


melhor preparo de amostra é não ter que prepará-la! --- Determinação direta
(diluição).
PREPARAÇÃO DA AMOSTRA

Filtragem:  procedimento  simples  em  que  deve  ser  observada  o  tipo  de 
filtração realizada e a capacidade de retenção do filtro.

Pode utilizar desde papel de filtro a diferentes tipos de membranas.

Dependendo do tipo de matriz analisada e do número de interferentes presentes


mais de um tipo de procedimento poderá ter que ser realizado.
PREPARAÇÃO DA AMOSTRA
PREPARAÇÃO DA AMOSTRA
PREPARAÇÃO DA AMOSTRA

TIPOS DE EXTRAÇÃO

A  Extração  Líquido-Líquido  é  simples  de  ser  realizada  no  que  diz  respeito   
aos  procedimentos,  porém  de  baixa  recuperação  e  com  demanda  alta  de 
tempo para que possa ser realizada. 

A    Extração  em  Fase  Sólida  (EFS)  é  uma  técnica  de  extração  simples  e 
rápida  que  necessita  de  pequenas  quantidades  de  solventes  e  uso  de 
cartuchos  ou  discos  de  extração  e  adsorventes,  tais  como  C18,  resina  de 
copolímero poliestireno, sílica, alumina B.

A  Micro-extração  em  fase  sólida  (SPME)  em  cartuchos  é  muito  utilizada,  já 
que  necessita  de  pequenas  quantidades  de  solventes  e  apresenta  altos 
valores de recuperação.

É INTERESSANTE EMPREGAR A TÉCNICA DE MODO ON-LINE!

Diminuição dos erros!


Universidade Federal de Pernambuco
Centro de Tecnologia e Geociências
Departamento de Engenharia Química

Análise qualitativa. Técnicas de


isolamento e identificação.
Análise quantitativa. Métodos de medição 
da área de cálculo.

Prof. Daniella Carla Napoleão

DEQ/UFPE
Análise Qualitativa e Análise Quantitativa

Quantitativa – tudo que pode ser mensurado em números,


classificados e analisados. Comum emprego de técnicas
estatísticas;

Qualitativa – não é traduzida em números, na qual pretende


verificar a relação da realidade com o objeto de estudo, obtendo
várias interpretações de uma análise indutiva por parte do
pesquisador.

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Análise Qualitativa

Objetivos: observação, descrição, compreensão e o significado.

Nesse tipo de análise não há hipóteses anteriores (pré-concebidas),


estas são construídas após a observação.

A que se ter cuidado com a coleta de dados, ou seja, é necessário


um estudo prévio sobre a prática e os métodos a serem
empregados.

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Análise Quantitativa

Pode ser tida como uma análise estatística em que se objetiva a


descrição de características de uma situação, a partir de
medições numéricas de hipóteses previamente levantadas.

Nesse tipo de análise a geração de medidas são precisas e


confiáveis.

São caracterizados pelo emprego da quantificação tanto nas


modalidades de coleta de informações, quanto no tratamento delas
através de meio de técnicas estatísticas: percentual, média, desvio-
padrão, análise de regressão, dentre outras.

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Medição Qualitativa – Cromatografia em Camada Delgada

Os dados de um único cromatograma, muitas, vezes, não


fornece informação suficiente que permita a identificação de
várias espécies presentes em uma mistura, devido à variação nos
valores de Rf , com o tamanho da amostra, à placa de camada
delgada e às condições de desenvolvimento.

IDENTIFICAÇÃO: a tentativa de identificação pode ser feita


aplicando-se na placa a amostra e as soluções das espécies
purificadas suspeitas de estarem presentes na amostra. A
identificação dos componentes pode ser feita através da
coincidência dos valores de Rf.

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Medição Quantitativa – Cromatografia em Camada
Delgada

•Quantitativa: Medição da foto-densidade das manchas na


placa de CCD;
• Semi-quantitativa: comparação visual da intensidade da
mancha problema.

“ A “interpolação” visual da intensidade da mancha problema,


entre duas manchas de referência, permite dizer que a
concentração na amostra encontra-se entre dois valores
referenciais.” A análise mais exata é obtida através do densitômetro
(equipamento que varre as manchas individuais, mediante a
reflexão ou a adsorção de um feixe de luz, através de uma
varredura ao longo da linha de eluição da placa.
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Medição Quantitativa – Cromatografia em Camada
Delgada
Exemplo: Separação planar de análise do ácido ascórbico em
suco de laranja.
A detecção é efetuada por uma leitora ótica da luz
transmitida ou emitida. O sensor ótico irá percorrer a
extensão da placa na vertical, registrando a intensidade da
luz como picos.
Outra maneira, mais barata, é a remoção dos componentes
separados mediante a raspagem da mancha correspondente
do adsorvente, depois de identificá-la por meio de técnica
não destrutiva. A CCD é a mais simples e a mais econômica
das técnicas cromatográficas quando se quer uma separação
rápida e identificação visual.
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Técnicas de Isolamento

As técnicas de isolamento de substâncias são peculiares a cada


tipo de análise utilizada e de analito a ser identificado. Quando
se trata de análise de compostos orgânicos é comum o emprego
de diferentes tipos de extração:

•Extração Líquido-Líquido;
•Extração Sólido-líquido;
•Micro extração;
•Extração a frio;
•Extração a quente.

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Técnicas de Isolamento

Recristalização

Um procedimento bastante empregado na purificação de um


composto é a técnica de recristalização, a qual é baseada na
diferença de solubilidade existente entre um composto
cristalino e as impurezas presentes no produto da reação.

É necessário que o solvente usado na recristalização


proporcione uma fácil dissolução da substância a altas
temperaturas e pouca solubilidade da substância a baixas
temperaturas .

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Técnicas de Isolamento

Observe uma técnica desenvolvida em um trabalho de pesquisa


para isolamento de fitotoxinas.

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Técnicas de Isolamento
Para o isolamento de complexos ativos é comum empregar
técnicas como: sublimação, destilação fracionada, destilação pelo
vapor de água sobreaquecido, filtração por géis, eletrodiálise, e
eletroforese. Além de técnicas de cristalização e recristalização.
Estudemos um pouco mais sobre eletroforese: técnica de
separação de partículas carregadas eletricamente (+ ou -), quando
submetidas a um campo elétrico externo.
Os cátions migram para o catodo e os ânions para o anodo, a
velocidade de migração das partículas dependerá do equilíbrio
existente entre a força eletromotriz (FEM) existente entre o campo
elétrico e a força retardante.
Esta técnica é semelhante à cromatografia em papel, embora os
princípios sejam diferentes.
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Técnicas de Isolamento
Eletroforese

As separações eletroforéticas podem ser realizadas de duas


formas bastante distintas: eletroforese em placa (ou em gel) e
eletroforese capilar.

Eletroforese em placa: método clássico de separação usado para


separar espécies complexas e de alta massa molar de interesse
biológico e bioquímico.

Eletroforese capilar: usada para separações analíticas


problemáticas, podendo substituir os métodos clássicos de
eletroforese.

DEQ/UFPE
Vimos em aulas anteriores que para identificar uma dada
substância é imprescindível realizar algumas determinações
previamente:
•Escolher corretamente o tipo de cromatografia a ser
empregada;
•Empregar uma coluna adequada, bem como a fase móvel a ser
utilizada;
•Dispor de solventes com alto grau de pureza;
•Verificar o volume e a técnica de injeção da amostra;
•Analisar e ajustar a temperatura do equipamento;
•Identificar a faixa de trabalho da curva analítica;
•Decidir sobre a necessidade de etapa prévia para a preparação
da amostra e qual técnica empregar;
•Escolher o padrão a ser analisado.
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Cromatografia Gasosa

Análise Qualitativa: baseia-se na velocidade com que cada


componente da mistura atravessa a coluna ---Tempo de Retenção
(Tr), ou seja, no tempo gasto desde o momento em que a amostra é
injetada, até o momento em que o maior número de moléculas da
substância sai do sistema cromatográfico e é detectado. Os
cromatogramas obtidos são usados para estabelecer a pureza
de compostos.

Análise quantitativa: está relacionada com a área formada sob os


picos, pois a intensidade do sinal enviado pelo detector é
proporcional à quantidade de substância presente na amostra.

DEQ/UFPE
Cromatografia Gasosa

Análise Qualitativa: os tempos de retenção devem ser úteis


para a identificação dos componentes das misturas. Entretanto,
a aplicabilidade dos dados é limitada pelo número de
variáveis que devem ser controladas para se obter resultados
reprodutíveis. Porém, a confirmação da presença/ausência
de compostos suspeitos de constituírem uma mistura torna a
na´lise autêntica.

DEQ/UFPE
No que diz respeito a escolha do padrão é preciso observar
os seguintes pontos:

• Escolha do padrão (material de referência);


• Solvente empregado (uso para cromatografia);
• Identificação da amostra;
• Construção da curva analítica: faixa de trabalho, determinação
dos limites de detecção e de quantificação);
Correta escolha dos pontos da curva (ideal 7 pontos) ---
Linearidade da curva;
• Determinação do tempo de retenção de cada componente.

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Determinação da concentração dos compostos de interesse
 Método de cálculo empregado
 Valor da área do pico cromatográfico
 Equação da curva analítica (calibração).
 Método validado.
 Número mínimo de análises a ser realizada.
 Reprodutibilidade.

 Análise dos erros estatísticos


Operações envolvidas: pesagem, medição de volume,
diluição, técnicas de injeção. (Aqui um cuidado especial para
toda aparelhagem envolvida é NECESSÁRIO).

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Testes Estatísticos

Para construir uma curva analítica dentro dos parâmetros de


validação vimos ser necessária análises em replicatas dos
diferentes pontos. Para que se possa verificar a concordância
dos resultados é necessário realizar análises estatísticas, como
por exemplo o Teste de Grubb’s. Essa análise consiste no
cálculo de G< e G>

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Testes Estatísticos
Exercício: De posse dos dados apresentados na Tabela abaixo,
determine os valores de G<, G>. Verifique se estão em
concordância com o valor de referência.

(*) Para um número equivalente a sete medições e com um nível


de confiança de 95% G< e G> devem ser inferior ao valor de
2,020.
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Testes Estatísticos
Exercício: De posse ainda dos dados da tabela determine o desvio
padrão entre as medidas de cada concentração.

Lembre que:

σ =

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Como calcular a área do pico cromatográfico?

Esta área pode ser calculada manualmente de duas maneiras:

Área do Pico (A): pode ser calculada traçando-se tangentes


nos dois lados do pico, a interseção destas duas tangentes com
a linha de base gera um triângulo, cuja área pode ser calculada
pela seguinte fórmula:

A = (dT x Wb)/ 2

Em que: A= área do pico, dT = altura do triângulo formado


pelas tangente e base do pico, Wb = largura do pico na linha de
base.
DEQ/UFPE
Como calcular a área do pico cromatográfico?

Esta área pode ser calculada manualmente de duas maneiras:

Área do Pico (A): pode também ser calculada usando-se a


largura a meia altura, isto é, medindo-se a largura na metade da
altura do pico:

A = d x Wh

Em que: d = altura do pico medida da linha de base até seu


vértice; Wh = largura do pico a meia altura.

DEQ/UFPE
Como calcular a área do pico cromatográfico?

Peso do Papel: a integração também pode ser feita pesando-se


o pedaço de papel delimitado pelo pico, que é o método
manual de preferência para picos altamente assimétricos.

Os métodos manuais são pouco empregados, sendo usados


processos de integração eletrônicos com auxílio de
softwares.

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Exercício: Calcule o valor da área do pico para o paracetamol
e a cafeína, identificados segundo o cromatograma abaixo.
OBS: Utilize os 2 métodos das áreas segundo as retas
tangentes e o do peso do papel.

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