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` Foi realizado um experimento de ͞microarray͟ com
hibridação de sondas de cDNAs de um ͞chip͟ de
oligonucleotídeos. Dois grupos foram comparados: o
primeiro continha um ͞pool͟ de amostras de cDNA
obtido de DNA de adenocarcinoma de mama (mesmo
tipo histológico e estadiamento) de sete pacientes. O
segundo grupo era um ͞pool͟ de amostras de cDNA
sintetizado a partir de tecido mamário adjacente ao
tumor das mesmas pacientes do grupo anterior, mas
com aspecto histológico normal. Explique os passos
necessários para se realizar estudos de expressão
gênica pela técnica do ͞microarray͟ no caso acima,
após a obtenção de cDNA.
Œetodologia
` O RNA deve ser extraído das amostras de
tecido normal e de adenocarcinoma.
` O pool de cDNA de amostras normais deve ser
preparado por RT (transcrição reversa)
utilizando nucleotídeos marcados com
fluorocromo cianina 3 (Cy3).
` O pool de cDNA de amostras de
adenocarcinoma deve ser obtido por RT
(transcrição reversa) utilizando nucleotídeos
marcados com fluorocromo cianina 5 (Cy5).
` O cDNA deve ser tratado com RNAse H a fim
de eliminar a fita de RNA original e manter
apenas a fita de cDNA simples marcada com
fluorocromo.
` Esses dois pools devem ser misturados e
hibridados na lâmina de microarray.
` A lâmina de microarray contém sequências de
DNA conhecidas simples fita nas quais os
pools de cDNA dos pacientes irão hibridar.
` Para cada experimento de microarray deve-se
fazer 3 réplicas.
` Após adição dos cDNAs de pacientes no chip
de microarray, esse chip é lavado para
eliminar cDNAs que não foram hibridizados na
lâminas
` O chip é levado ao um scanner capaz de
capturar a intensidade da marcação dos
fluorocromos verde (Cy3) e vermelho (Cy5).
` A intensidade dos pontos obtidos pelo
scanner são transformados em valores
numéricos pelo próprio scanner.
Análise dos dados
` Fazer as correlações entre as três réplicas a
fim de verificar a reprodutibilidade da medida
(Correlação de Pearson > 0,9)
` Fazer a normalização entre as réplicas para
tornar os dados comparáveis.
` Após os dados estarem normalizados fazer a
análise estatística para achar quais são os
genes diferencialmente expressos entre as
amostras analisadas. Geralmente usa-se o
SAŒ (Significance Analysis of Œicroarrays)
Œontagem da matriz de análise de Œicroarray

` å
representação das intensidades normalizadas em
função da média e SD.
Para cada gene, em cada amostra:
` Com a matriz obtida é possível analisar quais
são os genes que estão super expressos
(vermelho) e quais estão com expressão
diminuída (verde) nas diferentes amostras de
tecido normal e tumoral.
oídeo
` http://www.youtube.com/watch?v=SNbt--
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