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PRINCÍPIOS E APLICAÇÕES DE

CROMATOGRAFIA POR BIOAFINIDADE


AMANDA CRISTINA SANTOS DIAS 95124
JOSÉ CARLOS GONÇALVES COUTINHO 98113

Viçosa, 2018
INTRODUÇÃO

• Se difere das outras técnicas por estar baseada nas propriedades biológicas das
espécies que interagem na coluna;
• Preparação de uma fase estacionária seletiva, por imobilização covalente de ligantes
específicos à matriz ou suporte sólido;
• A amostra é aplicada à coluna que contém o ligante imobilizado no suporte sólido;
• As moléculas que estão na amostra, e não possuem afinidade pelo ligante passam
pela coluna, enquanto as moléculas que têm afinidade pelo ligante vão ficando
retidas em função da intensidade de sua afinidade pelo ligante.
INTRODUÇÃO

A eluição das moléculas ligadas pode ser feita por:

• Alteração do pH ou força iônica do meio;


• Alteração de temperatura;
• Emprego de substâncias que tenham maior afinidade pelo ligante da fase
estacionária.
INTRODUÇÃO

O sucesso do emprego deste método


cromatográfico depende: Animação (cromatografia de
afinidade)
• Matriz;
• Ligante específico;
• Condições de ligações;
• Condições de retenção;
• Eluição das moléculas de interesse.
MATRIZ

• Ser química e mecanicamente estáveis sob as condições de acoplamento;


• Variações de pH, força iônica, temperatura e presença de agentes desnaturantes;
• Uniformes, esféricas, porosas e rígidas;
• Possuir grupos químicos que possam ser ativados ou modificados para permitir a
ligação química entre uma variedade de ligantes.
MATRIZ

• Agarose;
• Celulose;
• Dextrana;
• Poliacrilamida;
• Vidro de porosidade controlada;
• Associações entre as substâncias citadas.
PREPARAÇÃO DA FASE ESTACIONÁRIA

A preparação da fase estacionária seletiva se dá em duas etapas:


• Ativação da Matriz;
• Acoplamento do ligante.
ATIVAÇÃO DA MATRIZ

• Na fase de ativação liga-se os grupos reativos a matriz inerte.


• os grupos OH ou NH2 da matriz são ativados através da reação com reagentes
bifuncionais do tipo A-R-B onde o lado do grupo A liga-se à matriz e o lado do
grupo B liga-se ao ligante.
ATIVAÇÃO DA MATRIZ

Ativação de matrizes hidroxiladas por Brometo de Cianogênio

1 – éster cianeto
2 – derivado carbamato
3 – imidocarbonato cíclico
4 – derivado imidocarbonato
ATIVAÇÃO DA MATRIZ

Ativação de matrizes não hidroxílicas

A ativação dessas matrizes se dá na


transformação do grupo amida em ácido
carboxílico, por hidrólise ácida ou alcalina;
em acil hidrazina, por reação com
hidrazina ou em aminoetil, por reação
com etilenodiamino.
ATIVAÇÃO DA MATRIZ

• O sucesso da purificação das macromoléculas se relaciona com a distância entre a


superfície do suporte e o ligante;
• A macromolécula pode sofrer um impedimento estérico quando o ligante está muito
próximo da matriz;
• o que pode ser resolvido com a adição de uma cadeia de hidrocarbonetos, denominada
braço.
ATIVAÇÃO DA MATRIZ
ACOPLAMENTO DO LIGANTE À MATRIZ ATIVADA

• Os principais grupos funcionais do ligante disponíveis para acoplamento são os


grupos carboxílicos, aminas, tióis e derivados sulfonados;
• A eficiência do acoplamento, de modo geral, aumenta com a concentração do
ligante;
• As concentração ideal de ligante para um acoplamento eficaz é de 1-10 mols do
ligante para cada mol de matriz ativada.
ACOPLAMENTO DO LIGANTE À MATRIZ ATIVADA
PREPARAÇÃO DA COLUNA

• Atentar para a escolha do tubo cromatográfico;


• Considerada adsorção da substância-alvo por ele;
• Podem ser adsorvidas algumas macromoléculas;
• Resistência ao solvente, quando se utiliza sistemas de eluição não aquosos.
PREPARAÇÃO DA AMOSTRA

• A amostra pode ser dissolvida no eluente que iniciará o processo


cromatográfico;
• Se a substância que se quer isolar for fortemente ligada a fase estacionária, seu
volume não é fator determinante para a qualidade da cromatografia;
• Já em casos onde a substância interage de forma moderada ou fraca com a fase
estacionária, recomenda-se que se utilize, no máximo 5% do volume da coluna.
VAZÃO E TEMPERATURA

• O efeito da vazão deve ser otimizado;


• Se a substância alvo não interage fortemente com o ligante e a vazão é alta, existe a
possibilidade de co-eluição;
• Com o aumento da temperatura ocorre a diminuição da afinidade da substância-alvo pela
fase estacionária;
• Fator que pode ser utilizado para a remoção da substância da coluna.
MÉTODOS DE ELUIÇÃO

• Agentes de eluição específicos;


• Agentes de eluição não-específicos;
• Agentes caotrópicos.
AGENTES DE ELUIÇÃO ESPECÍFICOS

• Utilizam da preferência da ligação da substância-alvo ao agente em detrimento do ligante


da fase estacionária;
• Agentes específicos apresentam estruturas químicas semelhantes às dos ligantes da fase
estacionária.
AGENTES DE ELUIÇÃO ESPECÍFICOS

Vídeo
AGENTES DE ELUIÇÃO NÃO-ESPECÍFICOS

• A variação do pH ou força iônica do tampão de eluição pode provocar


alterações no complexo macromolécula-ligante;
• Utiliza-se para eluição não-específica, variação de pH e/ou concentração salina
em etapas discretas ou gradientes.
AGENTES CAOTRÓPICOS

• Causam a desnaturação das macromoléculas;


• São utilizados quando nenhum dos agentes citados anteriormente foi eficaz na
remoção da substância-alvo do ligante;
• Alguns exemplos de agentes caotrópicos são ureia, percloratos tiossulfatos e
iodetos em concentrações elevadas.
RESINAS DISPONÍVEIS COMERCIALMENTE

Ligante Matriz Uso frequente


Fenil Agarose Isolamento de proteínas
Poliuridílico (Poly U) Poliacril hidrazina Separação de
oligonucleotídeos, RNA e
DNA
Concanavalina A Agarose Isolamento de glicoproteínas
DNA-celulose Celulose Protéinas ribossomais,
polimerase
APLICAÇÕES

ISOLAMENTO DE MACROMOLÉCULAS
APLICAÇÕES

PROCESSOS DE PURIFICAÇÃO QUE UTILIZAM A IMOBILIZAÇÃO


DE ÍONS
ARTIGO DE APLICAÇÃO

Purificação de catalase de fígado de camelo por cromatografia de afinidade de quelato


de zinco e eluição com gradiente de pH: uma enzima com propriedades interessantes
INTRODUÇÃO

 As mudanças climáticas e o aumento das temperaturas são


preocupações globais.

 O camelo (camelus dromedarius) vive a maior parte vida sob alto


estresse ambiental no deserto e representam modelo ideal para
estudar a adaptação do deserto entre os mamíferos.

 O camelo é continuamente exposto ao calor, radiação solar


e falta de água e comida.

 Este ecossistema específico pode resultar em uma


perturbação no equilíbrio entre a produção de EROs e
Camelus dromedarius defesas antioxidantes, e, portanto, causando danos de
importantes biomoléculas como DNA, proteínas e enzimas.
INTRODUÇÃO

• Geralmente, os organismos vivos são equipado com defesa antioxidante


enzimática e não enzimática mecanismos para se protegerem contra as EROs

• A catalase desempenha um papel fundamental na proteção das células contra o


estresse oxidativo.

2 H2O2  2 H2O + O2
OBJETIVO

• A purificação do catalase do fígado de camelo por cromatografia de afinidade por


quelantes metálicos usando eluição de gradiente de pH;

• E comparação de suas propriedades com as de outros enzimas catalases.


RESULTADOS

• Uma coluna de afinidade (1,6 × 9 cm) foi preenchida com


imminodiacético Sepharose 6 B;

• Ativada com 20 mM ZnSO4 · 7H2O solução;

• A amostra foi aplicada na primeira coluna equilibrada com


20 mM tampão de fosfato de potásio pH 7,0 contendo
NaCl 0,1 M;

• o CAT foi eluída à temperatura ambiente com um


gradiente linear de pH a partir de 20 mM de tampão de
fosfato de potássio pH 7,0 - tampão citrato 20 mM pH 5,0,
ambos os tampões contendo 0,1 M NaCl;

• Um fluxo constante de 60 ml / h.
RESULTADOS
RESULTADOS
CONCLUSÃO

Este estudo apresenta, pela primeira vez, a purificação do CAT de Fígado de camelo por cromatografia de
afinidade com quelato de zinco utilizando gradiente de pH eluição.
Este procedimento de purificação proporciona uma separação melhor, Maior atividade específica da enzima
purificada foi obtida.
REFERÊNCIAS

• COLLINS, C. H.; Braga, G. L.; Bonato, P. S. "Fundamentos de Cromatografia". Ed. UNICAMP,2009


• HOLLER, F. James. "Análise Instrumental". Porto Alegre; Ed. Bookman, 2009

• VOGEL, A. Israel. "Análise Química Quantitativa". Rio de Janeiro; LTC, 2011


• Chafika, A.; Essamadia, A.; Çelikb, S.Y.; Mavic, A., Purification of camel liver catalase by zinc chelate
affinity chromatography and pH gradient elution: An enzyme with interesting properties. Journal of
Chromatography B, v. 1070, p. 104-111, 2017.
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