Contagem de coliformes totais e

coliformes termotolerantes em alimentos

Prof. Pedro Cardines
Definição
 COLIFORMES TOTAIS: grupo de bactérias constituído por
bacilos gram-negativos, aeróbios ou anaeróbios facultativos, não
formadores de esporos, oxidase-negativos, capazes de crescer na
presença de sais biliares e que fermentam a lactose com produção
de aldeído, ácido e gás a 35ºC em 24-48 horas. O grupo inclui os
seguintes gêneros: Escherichia, Citrobacter, Enterobacter e Klebsiella.

 COLIFORMES FECAIS OU COLIFORMES

TERMOTOLERANTES: são coliformes capazes de se
desenvolver e fermentar a lactose com produção de ácido e gás à
temperatura de 44,5 ± 0,2°C em 24 horas. O principal
componente deste grupo é Escherichia coli, sendo que alguns
coliformes do gênero Klebsiella e Citrobacter também apresentam
essa capacidade.
Definição
Coliformes- significado em alimentos
 Totais: Utilizado para avaliar as condições higiênicas, sendo
que altas contagens significam contaminação pós-
processamento, limpezas e sanificações deficientes,
tratamento térmicos ineficientes ou multiplicação durante o
processamento ou estocagem.
 Termotolerantes: empregado como indicador de
contaminação fecal, ou seja, de condições higiênico-
sanitárias, visto presumir-se que a população deste grupo é
constituída de uma alta proporção de E. coli, que tem seu
habitat no trato intestinal do homem e de outro animais.
Além de indicar possibilidade de presença de outros
patógenos entéricos.
 Técnicas

» Plaqueamento (sólido): aplica-se a amostras de matérias-

primas, alimentos e rações, devendo ser utilizada quando o limite
máximo tolerado ≥ 100 UFC/g ou mL.

»NMP (líquido) em alimentos: aplica-se a amostras de matérias-

primas e alimentos, devendo ser utilizada quando o limite
máximo tolerado for inferior a 100 NMP/g ou mL

»NMP (líquido) em água e gelo: Aplica-se a amostras de água e

de gelo usados em estabelecimentos produtores de alimentos. O
valor é obtido em NMP/100mL.
Pesquisa de coliformes: método em placas.
 Ágar cristal violeta (VRBA)
 sais biliares e cristal violeta que inibem Gram+;
 Vermelho neutro (indicador)- revela a fermentação da lactose.

Caldo verde brilhante bile 2% lactose

 Bile bovina e corante verde brilhante que inibem Gram+.

Caldo EC
 Sais biliares – inibem Gram+;
 Mistura de fosfatos– impedem a acidificação do meio.

Ágar eosina azul de metileno (EMB)

 Eosina e azul de metileno são corantes inibidores de Gram +. Com a
fermentação da lactose e produção de ácido, ocorre precipitação desses corantes
que fornecem o brilho verde metálico característico da E. coli.
 Plaqueamento sobrecamada

15 mL

Em posição invertida

Prova presuntiva
Selecionar 3 colônias típicas e
para coliformes totais 3 atípicas para investigar

Prova confirmativa Cada colônia para um caldo verde brilhante

para coliformes totais

Prova confirmativa Para cada tubo positivo no caldo

verde brilhante passar para um
para coliformes
45C°/24 a 48h
tubo de caldo EC
termotolerantes
Caracterização da E. coli
De cada tubo EC positivo
Técnica de esgotamento – por estrias
Testes bioquímicos para coliformes-
identificação da E. coli
1. Prova do Indol;
2. Vermelho de metila-VM;
3. Voges-Proskauer-VP;
4. Citrato.
 1. Prova do Indol
Triptofano triptofanase Indol + ácido pirúvico + amônia
desaminação

+ p-dimetilaminobenzaldeído +HCl + álcool (reativo de Kovacs)

Composto quinoidal (vermelho)

CH2 do anel pirrólico da molécula do indol + o aldeído

em meio ácido= quinona
 2. Vermelho de metila-VM

ácido láctico
ácido acético
Glicose fermentação ácido fórmico
ácido mista ácido succínico
ácido etílico
INDICADOR:
Vermelho de metila – escala de 4,4 a 6,0.
pH 4,4 cor vermelha - prova positiva
pH 6,0 cor amarela (acetoína) - prova negativa
 3. Voges-Proskauer-VP
Fermentação
Glicose butilenoglicol

2 ác. pirúvico
Agente
descarboxilação oxidante

Acetilmetilcarbinol + ∝-naftol +KOH 40% Diacetila

(acetoína)
Catalisador

Diacetila + núcleo guanidina do ∝-naftol condensação Composto

Vermelho

OBS .: cor cobre é resultado negativo

 4. Citrato Indicador de pH: azul de bromotimol
pH 8,4=coloração azul-da-prússia
pH 6,9= coloração verde
pH 6,0= coloração amarela
ciclo de Krebs ;
Citrato citratase
ciclo da fermentação do citrato

Citrato piruvato + CO2

CO2 + sódio carbonato de sódio

Amônia como
pH
alto
fonte de N