Bibliografia Marcadores

Moleculares
 Killops, S, Killops, V. 2005.
Introduction to organic
geochemistry 2nd Edition Chapter 5
”Chemical stratigraphic concepts
and tools” p 166-245 Blackwell U.K
 Poynter, J, Eglington, G 1991 “ The
biomarker concept-strenghts and
weaknesses “. Fresenius J Anal.
Chem 339:725-731
 Bibliografia
 Brocks J.J, Summons, R.E 2005
“Sedimentary hydrocarbons,
biomarkers for early life” Chapter
8.03 p 64-114 IN Vol 8 “
Biogeochemisrty” - Treatise on
Geochemistry. Elsevier 701p
 Geoquímica orgânica
– Básicamente é o estudo das
reações e processos que
ocorrem com as moléculas
orgânicas no no Sistema
Terra.
 Os processos são tanto mediados
biológicamente ou ainda controlados
pelas variáveis simples como a
Temperatura e Pressão, no caso dos
orgânicos ocluídos no interior da Terra.
 Vida , moléculas e registros
geológicos
 A vida deixa tanto registros físicos visíveis a olho
nú( esqueletos, carapaças), ou ao
microscópio(microalgas) ou ainda moléculas orgânicas
fósseis no registro sedimentar.
 Os fósseis quimicos* ou marcadores moleculares, podem
dar indicações precisas da sua origem biológica inicial a
partir da sua composição isotópica e da estrutura
molecular.Podem ainda estimar as condições ambientais
reinantes no passado geológico.
Marcadores Moleculares Orgânicos
 São moléculas orgânicas encontradas
em sedimentos,rochas, betume ou
petróleo que não sofreram alterações
significativas na sua estrutura básica
original que apresentavam nos
organismos vivos.
 Em outras palavras a assinatura
química original é preservada apesar
dos processos biológicos ou
geoquímicos a que foram submetidas.
Marcadores Moleculares- Histórico

 O primeiro relato de um marcador

molecular é de 1934 quando Treibs
isolou moléculas de porfirinas tanto
do petróleo como de sedimentos
marinhos antigos e associou os
fatos. A origem das porfirinas de
ambas matrizes é a mesma : a
molécula original da clorofila.
 Papel biológico porfirinas
 O núcleo básico da porfirina, que é um anel
plano com 12 átomos de C e 4 de N no
centro, é a base da construção de vários
pigmentos de grande importância
bioquímica. No caso da clorofila o Mg é o
metal complexado no centro do anel. Na
hemina, o pigmento do nosso sangue e
bile, é o Fe o átomo complexado no anel
porfirínico.
 As cadeias laterais esterificadas podem ser
álcoois de cadeia longa como o fitol no
caso da clorofila.
 Esta descoberta levou Treibs
acertadamente a propor a origem biológica
para o petróleo e que os compostos
precursores do petróleo não poderiam ter
sido submetidos a temperaturas muito
altas, pois senão as porfirinas teriam sido
completamente destruídas.
 Isto significa que algumas moléculas
orgânicas complexas podem sobreviver
milhões de anos dentro de rochas ou
sedimentos.
 Marcadores Orgânicos em
Geoquímica: fósseis químicos
» Devido a eficiência da remineralização da
matéria orgânica ,poucas moléculas conservam
sua estrutura inteira intacta ou mesmo seu
esqueleto carbônico original. Assim compostos
orgânicos que resistem a destruição parcial das
suas estruturas originais pelo processos
biogeoquímicos foram chamados de
Fósseis Quimicos” por Eglinton(1967).
 Após o trabalho pioneiro de Treibs com as porfirinas
, a identificação de novos marcadores na década
de 60 foi possível graças à cromatografia em fase
gasosa. Esta técnica permite a separação de
misturas complexas de compostos orgânicos em
matrizes naturais.
 O acoplamento da cromatografia de gás à
espectrometria de massa nos anos 70, facilitou
mais ainda identificação de inúmeros novos
marcadores moleculares.
 CROMATOGRAFIA

Cromatografia

Métodos de resolução de
substâncias em uma mistura

Fase móvel

Separação cromatográfica

Fase estacionária
 Gas Chromatograph

Injection Port

Detector
Capillary Column

Data System
or Recorder

Carrier Gas Oven

Supply
 240

200

Temp (deg C)
160

120

80

40

0
0 10 20 30 40 50 60
Time (min)
detetores

(a) (b)

(c.1)

(c.2)
Cromatógrafo
 Gas Chromatography
E A

D Gas
Chromatograph
B
C

Sample: mixture of
volatile liquids (~1µ L)

Gas Chromatogram

B
E
C
A
ec nadnub A

0 5 10 15 20
Time (minutes)
Cromatografia com DIC ou com
Espectroscopia de Massa
 No caso de detectores como o de ionização de
chama a identificação é feita com base no
tempo de retenção do pico , comparado com o
de padrões comerciais ou sintetizados no
próprio laboratório. Assim precisamos de um
número enorme de padrões que são de alto
custo ou investir tempo nas sínteses
 Já com acoplamento CG-EM a identificação é
feita pela razão massa/ carga do íon
comparada com as M/z s de uma biblioteca de
espectros.
 Mass Spectrometer

Sample Data
Introduction Output

Inlet Data
System

Ion Mass Ion

Source Analyzer Detector

Vacuum
Pumps
 Electron Impact
Ionization Source
~70 Volts

Electron Collector (Trap)

Positive
Ions
+
Repeller Neutral Inlet __
Molecules
+ + + to
+ + +
+ Analyzer

e- e- e-
_ Electrons

Filament Extraction
Plate
 Magnetic Sector Mass Analyzer

ion trajectory
in register
ion trajectory
not in register
(too light)

Ion Detector
Source
N ion trajectory
not in register
Electromagnet (too heavy)
 Quadrupole Ion Filter

resonant ion

non-resonant ion

_
Detector
+
+
_

Ion
Source

DC and AC
Voltages
 Mass Spectrometer

Sample Data
Introduction Output

Inlet Data
System

Ion Mass Ion

Source Analyzer Detector

Vacuum
Pumps
 Mass Spectrometry
O C H3

H3C C N
N C
C H Mass
C C Spectrometer
O N N
H

Typical sample: isolated

compound (~1 nanogram)

194
Mass Spectrum

67 109
Abundance

55
82

42

94 136 165

40 60 80 100 120 140 160 180 200

Mass (amu)
 Uso de marcadores moleculares
como traçadores de origem
 Em 1967 Eglington passou a usar
hidrocarbonetos encontrados em
sedimentos marinhos ou organismos
como traçadores de origem do material
 Uma das primeiras aplicações foi no
estudo da contaminação por petróleo de
organismos e sedimentos. Pela
distribuição dos alcanos (parafinas) é
possível determinar a origem destes
compostos.
Hidrocarbonetos como traçadores
 Hidrocarbonetos biogênicos ou
seja os naturais, apresentam
predominânica de parafinas com
número par de átomos de carbonos
no seu esqueleto. Já os
hidrocarbonetos de petróleo, ou
seja de origem antropogênica,
apresentam uma distribuição
equitativa de hidrocarbonetos de
número par e impar de carbonos.
 C12

C13

C14 Tetradeceno

C15
FID1 A, (T EBAGO08\SEDTEB5.D)

C16 Hexadeceno

C17
Pristano

C18
Fitano

C19

C20 Eicoseno

C21

C22

C23

C24

C25

C26

C27
Amostra de sedimento com n-alcanos naturais

C28

C29

C30

C31

C32

C33

C34

C35
 C12

C13

C14
FID1 A , (RLA MA H09 \C UR V T H P 1.D )

C15

Hexadeceno C16

Pristano C17

Fitano C18

C19

Eicoseno
C20

C21

C22

C23

C24

C25

C26
Amostra de petróleo da Baía de Todos os Santos

C27

C28
C29
C30
C31
C32
Cromatograma de uma amostra de sedimento com UCM
 A análise dos hidrocarbonetos polinucleares
aromáticos(HPAs) de uma amostra ambiental
também auxilia na identificação da sua origem .
Pela distribuição relativa dos HPAs não alquilados
e alquilados no cromatograma ou no EM dá para
saber se estes compostos vieram da combustão de
biomassa, carvão ou de derivados do petróleo.
 O Laboratório de Química Orgânica Marinha do
IOUSP utiliza em rotina os marcadores moleculares
como traçadores de origem.
 Razões isotópicas acoplada a CG-
MS
 Com o acoplamento da cromatografia de
gás simultaneamente a determinação das
razões isotópicas numa só injeção, como é
o caso do equipamento IRCGMS que foi
mostrado a vocês no laboratório da
Geoquímica Marinha, fica ainda mais
facilitada a identificação da origem do
material se marinho ou terrestre ou mista.
 Definição atual de Marcador
Molecular
 “ Uma molécula orgânica cujo esqueleto
carbônico pode ser ligado inequivocamente à
um precursor biológico definido”

 Algumas moléculas sómente são produzidas

por certas espécies ou classes de organismos
, assim sendo sua ocorrência pode ser
associada a existência prévia destes
organismos naquele ambiente.
 Áreas de aplicação dos
marcadores moleculares
 Exploração de petróleo e gás
 Paleoceanografia
 Exploração da biosfera, origem da
vida
 Arqueologia
 Estudos microbiológicos
 Exobiologia
 Requisitos para uso de
marcadores moleculares
Os compostos devem ser possíveis de
serem determinados quantitativamente
em matrizes naturais complexas
fornecendo:
-Identificação das estruturas moleculares
-Composição isotópica
-Origem biológica claramente associada
a um grupo de organismos.
 Requisitos para marcadores
moleculares
 Isso implica num o esqueleto carbônico bem
definido e com características próprias devido a
especificidade do processo biossíntético.
 Blocos de Construção bem definidos
 Exemplo é sequência isoprênica C=C-C=C
 C Isopreno é
elemento básico de construção de vários
compostos com 10,15 ou 20 Cs.São os
terpenos( do Grego terebinthos, Portugues.
terebentina). No ambiente marinho o esqualeno é
um exemplo de terpenóide sendo o precursor do
colesterol.
Diterpenos importantes na ambiente
marinho
 Phytol derivado da clorofila


 Paleo-oceanografia Clássica
 Antes do uso generalizado de
marcadores moleculares a forma
clássica de avaliar a contribuição
sedimentar para os ambientes atuais,
era o estudo dos fósseis marinhos,
visíveis pela microscopia como restos
de esqueletos calcáreos ou silicosos.
Posteriormente passou-se a usar as
razões isotópicas de C 13, N15 e O16
eO18 nestas carapaças.
 Estratigrafia química
Químiotaxonomia Paleoceanografia
 O exemplo clássico são os esqueletos de
foraminíferos marinhos.
 Ocorre que nem sempre os sedimentos
 mais antigos preservaram estes restos de
organismos.
 Em contraste os lipídeos são bem preservados
fazendo parte da constituição bioquímica
original do
 Requisitos de Biomarcadores
 organismo. Os hidrocarbonetos
em geral, ácidos graxos e
alcooís superiores são bem
preservados nos sedimentos
marinhos e nas rochas
geradoras de óleo. Deste modo
na prática são os marcadores
moleculares mais utilizados em
rotina.
 Características dos Biomarcadores
 .Mas isto não significa que qualquer
lipídeo ou hidrocarboneto sirva como
marcador ideal. O marcador não precisa
conservar todos seus grupos funcionais
originais como COOH, OH, NH2, etc
durante os processos de diagenese,
metagenese mas precisa conservar seu
esqueleto principal.
Alterações da estrutura original dos
marcadores moleculares
 Durante a diagênese nos sedimentos
os marcadores sofrem as mesmas
reações que os outros orgânicos do
sedimento:
 Perda dos grupos funcionais
 Aromatização( perda de Hs)
 Isomerização
 A diferença é que o esqueleto
carbônico básico é conservado
 Paleo-oceanografia Clássica
 Tradicionalmente a relação O18:O16 do restos
de fósseis de invertebrados marinhos
 ( testas carbonáceas), encontrados no
sedimentos tem sido usada na determinção das
paleotemperaturas dos oceanos, mas a
extensão das glaciações, o balanço da
evaporação e precipitação, a profundidade. de
compensação do carbonato e a diagênese
afetam a exatidão destas determinações
 Marcadores moleculares e a
paleotemperatura dos oceanos
Tradicionalmente os marcadores
moleculares são muito utilizados
pela industria de petróleo para
caracterizar os diversos tipos de
óleo e sua maturidade. Uma nova e
fascinante aplicação dos
marcadores moleculares é nos
estudos da paleotemperatura dos
oceanos
 Uso das alquenonas
Uma alternativa ao uso das
testas de fosséis e a relação
O16/O18 é usar um marcador
molecular. As alquenonas são
cetonas insaturadas de cadeia
longa, C37-C39, presentes em
algas halofitas, como a
Emiliana huxleyi.
 Emiliana huxleyi
Esta alga é ubíqua em todos oceanos e
suas assinaturas moleculares estão
presentes em praticamente todos
sedimentos marinhos e lacustres,
registrando assim as variações dos
blooms de fitoplâncton que ocorreram no
passado geológico.
 Ocorrência das alquenonas

 A maior fonte das alquenonas é o cocólitoforito

“Emiliana Huxley” Estudos com culturas destas
algas mostraram que o número de duplas ligações
era função da temperatura de cultivo.
 O grau de insaturação, isto é o, número de duplas
ligações entre os Cs , das alquenonas encontradas
nos sedimentos, esta associada as quedas de
temperatura ocorridas nos oceanos no passado.
Aumentando as duplas ligações diminui o ponto de
fusão destes lipídeos permitindo a sobrevivência
desta alga em temperaturas mais baixas.
 Isto porque são os lipídeos é que
garantem a fluidez celular. As
alquenonas resistem bem aos
processos diagenéticos, sendo os
lipideos mais estáveis que
conhecemos;
 Para calibração do método é usada
a relação das alquenonas C 37:2 e C
37:3. Esta notação refere-se a
posição das duplas ligações
 Aplicações dos marcadores
moleculares no Atlântico Sul
 Tese de Livre Docência da Prof.a
Márcia Caruso Bícego em 2007
IOUSP
 “ Reconstrução paleoceanográfica
dos últimos 7500 anos na
plataforma continental do Atlântico
Sudoeste baseada em marcadores
geoquímicos orgânicos”
 Tese de Doutorado de Rafael
Lourenço 2007 IOUSP
 “ Aplicação de marcadores orgânicos
moleculares em estudos
oceanográficos e
paleoceanográficos: Estudo de caso
na Margem Continental Superior do
Sudeste do Brasil 142p
 Em ambos trabalhos foram usados os
hidrocarbonetos, alquenonas, esteróis,
ácidos graxos e álcoois superiores
como marcadores moleculares nos
testemunhos de sedimentos. Foi
possível inferir claramente mudanças
de temperatura e de produção
primária no período de alguns milhares
de anos com estes marcadores.
 Lipídeos como Marcadores:
Metodologia Analítica
 Os lipídeos na coluna de água,
sedimentos ou organismos estão na
forma livre ou químicamente ligados.
Dependendo do tipo de estudo é
necessária um extração diferenciada
dos dois da matriz original.
 A extração simples com um único
solvente remove os lipídeos livres. *
 Definição de Lipídeos
 * Lipídeos são todas substâncias
produzidas por organismos, que são
praticamente insolúveis em água, mas
facilmente solúveis em em solventes de
gorduras tais como clorofórmio,
tetracloreto de carbono, éteres,
hidrocarbonetos alifático e aromáticos e
acetona” apud Bergmann, 1963
 A definição é “ OPERACIONAL” não
definindo classe pelos grupos funcionais
 Lípideos saponificáveis e
insaponificáveis
 Os Ácidos Graxos e seus ésteres
(Gorduras) são solubilizados pela
saponificação em meio alcalino forte.
 Já Alcoois, Esteroídes e hidrocarbonetos
não são afetados pelos alcalis
 Já na extração da matriz original(sed/org)
podemos usar esta diferença para uma
separação prévia por tipos .
 Lipídeos Polares e Apolares
 Apolares ou neutros:Cêras, ésteres de
ácidos carboxílicos( gorduras),esteróis
hidrocarbonetos.
 Polares: Principalmente fosfolipídeos
mas também inclui as lipoproteínas,
carotenóides, pigmentos da clorofila.
 Papel Biológico dos Lipideos
Neutros e Polares
 Os polares constituem os principais
componentes das membranas celulares
dos seres vivos, servindo ainda de
agentes de transmissão e recepção
nervosa.
 Os neutros tem como função principal
estocar energia nos organimos.
 Os lipídeos estão entre os compostos
orgânicos mais abundantes dos
organismos.
 Estruturas químicas do lípideos
usados como marcadores
 Extremamente diversificadas
 Hidrocarbonetos simples
 Ácidos graxos livres
 Álcoois superiores
 Terpenóides
 Esteróis
 Hopanos
Etapas do procedimento analítico
 Extração
 Purificação dos extratos – Clean Up
 Derivatização(Opcional).
 Analise final por cromatografia de gás
com Detector de Ionização de Chama
ou acoplada a Espectrometria de
Massas
Extração
Clean up
Cromatografia
 Lipídeos predominantes em
matrizes biológicas
 São os hidrocarbonetos e ácidos graxos
 No Fito e Zooplâncton marinhos:
 Ácido Graxo predominante é o n-C16
 Hidrocarbonetos: n-C17 e n-C18
 Nas Plantas Terrestres Superiores temos
 ácidos graxos pares de maior PM como n-
C28, C30 e C32. Já nas cêras cuticulares
 hidrocarbonetos ímpares n- C27, C29 e C31
Unidades básicas de esqueletos de C
dos lípideos marcadores
 Os lipídeos marcadores
apresentam dois tipos principais
de cadeias
 C
 Poli-isoprenos (C=C-C-C) n

 Poliquetídeos
Lipídeo de plantas terrestres