Biotecnología

Unidad 2: Proteínas como producto. Estructura y procesamiento.

Prof. Tamara Zilocchi

De las ballenas al detergente… ¿Cómo?
 ¡Biotecnología!
Incluso cuando se descubre una
proteína y una aplicación se
corresponde a su característica se
necesita mucho trabajo para
producirlas con la cantidad y
calidad necesarias para un uso
comercial.

Si bien no hay un método optimo

para procesar proteínas, si hay
técnicas de uso habitual.
  Las proteínas son grandes moléculas necesarias para la
estructura, función y regulación de las células vivas.
 Cada molécula de proteína tiene una función única en
las reacciones bioquímicas que sustentan la vida.

 Están compuestas por cadenas de aminoácidos.

 Tienen pesos moleculares específicos y carga eléctrica
que las hace interaccionar con otros átomos y
moléculas.
¿Qué son las Esta capacidad de interacción
es la clave de la actividad
proteínas? biológica de las proteínas.
 ▪ Las proteínas pueden tener 4 niveles de organización que
van a ser dependientes de la secuencia química
especifica de sus subunidades de aminoácidos.

Organizació ▪ Estos niveles son:

n -Estructura primaria.

estructural -Estructura secundaria.

-Estructura terciaria.
-Estructura cuaternaria.
 • Estructura
primaria
 Los20 aminoácidos habituales son los
monómeros de las proteínas.
 Se pueden unir de 10 a 10.000 aminoácidos
desde la cabeza hasta la cola.

 La secuencia en la que están unidos de forma

lineal los aminoácidos es la estructura primaria.
 Se producen cuando las cadenas de proteínas
se pliegan o giran en puntos concretos gracias
a la capacidad de rotación del carbono,
estableciendo nuevas formas por la creación
de enlaces de hidrogeno entre los
aminoácidos.
 Las formas mas comunes son las hélices alfa y
las laminas plegadas beta.

• Estructura
secundaria
 Muchas proteínas
• Estructura tienen
terciaria
estructura
globular
terciaria caracterizadas por
ser solubles en agua,
sin embargo no
 Son polipéptidos tridimensionales que todas las proteínas
se forman cuando las estructuras llegan a formar
estructuras
secundarias se combinan y se unen
terciarias, como es
entre si. el caso de las
 Los enlaces que mantienen unidas a las llamadas proteínas
filamentosas.
estructuras terciarias tienen lugar entre
aminoácidos capaces de formar enlaces
secundarios (como la cisteína que
puede generar enlaces disulfuro).
 Son complejos únicos, tridimensionales y
globulares, compuestos por varios
polipéptidos iguales o diferentes con
estructuras terciarias que quedan
autoensambladas por enlaces débiles, no
covalentes.

• Estructura
cuaternaria
 ▪ Como hemos visto, de la estructura de la proteína deriva
su función; Por lo tanto, el plegamiento es esencial al
Plegamient momento de comprender como distintas hebras de
aminoácidos adquieren su forma y desarrollan su función.
o de ▪ Si la proteína se pliega incorrectamente no solo se
proteínas perderá la función deseada de la misma, sino que puede
resultar dañina.
Muchas enfermedades que
conocemos son producto del mal
plegamiento de proteínas: Alzheimer,
Anemia Falciforme, Fibrosis quística.
Incluso muchas formas de cáncer e
infartos se han relacionado con este
defecto.
Se entiende entonces, que si el
plegamiento natural presenta
problemas, este consista en uno de
los mayores retos que tendrá la
biotecnología en el procesamiento de
proteínas.
  Enlace hidrogeno:
-Los hidrógenos son simples protones rodeados de un
electrón.
-Cuando el oxigeno y el nitrógeno contactan con
Química átomos de hidrogeno, buena parte de la nube de
electrones del hidrogeno se aleja, dejándolo cargado
positivamente.
-Si el átomo de hidrogeno con carga positiva contacta
con un átomo con carga negativa, habrá atracción y se
Repaso producirá el enlace.
Aplicación
temática

 Hélices alfa:
-Los aminoácidos forman una espiral dextrógira.
-Los enlaces de hidrogeno estabilizan la estructura,
uniendo un átomo de nitrógeno de un aminoácido con
un átomo de oxigeno de otro.
-Estas uniones se dan en intervalos regulares, lo que
genera la espiral.
Aplicación
temática

 Laminas beta:
-Los enlaces de hidrogeno unen átomos de nitrógeno y
oxigeno.
-La diferencia con las hélices alfas es que, como los
aminoácidos pertenecen a cadenas que discurren
paralelas, se forma una lamina plana.
-Las laminas pueden ser:
*Paralelas  todas las cadenas discurren en
la misma dirección.
*Antiparalelas  las cadenas alternan en
dirección.
*Mixtas
Los giros beta son elementos fundamentales
de la estructura proteica, que establecen
puntos de conexión entre hélices alfa y/o
laminas beta.
Son secuencias cortas con una conformación
característica que impone un brusco giro de
180° a la cadena principal de un polipéptido,
al unirse el O del carbonilo con el H de la
amida, separados por 3 posiciones.
Sirven para que la proteína adopte estructuras
mas compactas.
  Glucosilación:
-Proceso mediante el cual se añade un glúcido (hidrato
de carbono) a otra molécula.
-La glucosilación puede llevarse a cabo en muchas
Química moléculas, las proteínas siendo una de las mas
comunes.
-Este cambio puede afectar significativamente
la actividad de la proteína  Aumentar la solubilidad
Repaso y aplicación  Alterar la bioactividad

temática
Esto quiere decir que
es un proceso que
puede influir
directamente en la
cantidad de proteínas
producidas en un
organismo.
Ingeniería y producción de
proteínas
 Ingeniería
Las técnicas de evolución
molecular dirigida han permitido
que se pueda introducir
alteraciones especificas y
predefinidas en la secuencia de
nucleótidos de un gen concreto,
generando productos de mayor
actividad.
Estos genes modificados luego
pueden introducirse en una célula
huésped.
Los priones son partículas proteicas infecciosas que atraen
proteínas celulares normales e inducen cambios en su
estructura.

Producen enfermedades como el Kiru y la TSE.

Desde el laboratorio se logro formar partículas sintéticas para

desarrollar métodos de control y detección.
 ▪ Generar proteínas es un proceso largo y laborioso.
▪ Las dos fases principales de producción son:
-Upstream processing (etapas iniciales)
-Downstream processing (etapas finales)

Producción
de Comprobación Desarrollo de
Expresión de la Separación y
proteínas proteína en la
célula
aislamiento de la
proteína
de la pureza y
capacidad
medio estab
que preserve
funcional proteina.
  La primer decisión que debemos tomar al iniciar la fase
Upstream es seleccionar la célula que vamos a utilizar
como fuente de proteínas.

Expresión de
proteínas -Microorganismos
-Hongos
-Células vegetales
-Células animales
 Microorganismos

 Fermentación.
 Se pueden cultivar grandes cantidades en poco tiempo.
¿Por qué elegirlos?
 Son relativamente sencillos de alterar genéticamente.

 Se introducen copias adicionales del gen en cuestión

Métodos de ADN en una célula huésped.
recombinante  Se introduce el gen relevante en el organismo cuando
se ha colocado un control de la expresión bajo un
promotor de la transcripción mas potente.
La especie de bacteria mas utilizada
para producir proteínas es la E.Coli.

En la mayoría de los casos cADN se une

directamente a un gen completo o
parcial de E.Coli, lo que resulta en la
producción de proteínas de fusión, por
lo cual finalmente será necesario otro
proceso para poder separar la proteína
diana.
  Los cultivos celulares de gran
volumen se realizan
habitualmente en un sistema
autocontenido y cerrado hasta
que se retira el producto.

Biorreactor  A través de puertos estériles, los

trabajadores pueden ajustar
condiciones de pH,
concentraciones de gas,
temperatura y otras variables.
 Hongos

 Las proteínas naturales de algunos hongos son

nutritivas y se usan como fuente de alimentos.
 Muchas proteínas producidas por los hongos tienen
¿Por qué elegirlos? buena prestancia a la manipulación genética.
 Al ser eucariotas, pueden realizar algunas
modificaciones postraduccionales y pueden plegar
proteínas humanas correctamente.
 Células vegetales

 Las plantas son una fuente abundante de moléculas

naturales, biológicamente activas.  Hoy en día el 85%
de los fármacos puede encontrarse en plantas.
¿Por qué elegirlas?  Se puede también modificar genéticamente a las
plantas para que produzcan proteínas especificas que
Ejemplo
no tienen lugar naturalmente.

Inconvenientes
Papaína/pepsina vegetal;  No todas las proteínas pueden ser expresadas en las
enzima proteolítica que plantas.
puede utilizarse como
 Como las plantas tienen paredes celulares duras, el proceso
agente ablandador de la
carne (digiere el colágeno) de extracción puede ser laborioso y difícil.

 Si bien son capaces de glucosilar, el proceso es ligeramente

diferente al que tiene lugar en las células animales.
 Sistema de células
en mamíferos

 Si bien la producción de proteínas en base al cultivo

de células animales es la única opción en algunos
casos, el proceso es un poco mas complejo que los
que venimos enumerando.
 Los requisitos nutritivos, incluso en una placa de
Petri, son mayores que el de las células microbianas.
 Crecen relativamente mas despacio y se necesitan
sembrar una mayor cantidad en los biorreactores.
 Este crecimiento lento también aumenta la
posibilidad de que los cultivos se contaminen.
 Sistema de producción
en animales

 En algunos casos los productores de proteínas son animales vivos.

 Como vimos anteriormente, pueden obtenerse como productos de
la intervención en animales utilizándolos como biorreactores,
como sucede en el caso de la obtención de anticuerpos
monoclonales; o pueden ser el producto que se obtiene de
animales transgénicos que elaboran proteínas que sus
contrapartes no.
  El primer paso de la cadena downstream es la extracción de la
proteína:
-Extracelular La proteína se excreta al medio de cultivo.
-Intracelular  Se recoge toda la célula.
 Lo que deviene es la separación de la proteína diana de las
complejas moléculas biológicas.

 Protocolo común de acción:

-Preparación del extracto para su purificación.
Lisis celular
Purificación de
proteínas -Estabilización de las proteínas en solución.
Control de temperatura
Inhibidores de proteasas
Antimicrobianos
-Separación de los componentes del extracto.
Precipitación de proteínas
Métodos de separación por filtración.
Cromatografía
Métodos analíticos
  Las proteínas suele tener aminoácidos hidrófilos en su superficie
que atraen e interaccionan con moléculas de agua  esta
característica nos sirve como base para separar proteínas de
Precipitación otras sustancias del extracto.

de proteínas  Comúnmente se agregan sales (sulfato de amonio) a la mezcla de

proteínas para provocar que se separen en el fondo de la solución.

 En ciertos contextos como el industrial, el sulfato de amonio no es

propicio (reacciona con el acero inoxidable)  otros solventes que
se utilizan en la precipitación son : etanol, isopropanol, acetona y
dietil éter.
 Filtración
 Los procesos de filtración se adecuaran al tamaño y la densidad de
las moléculas.
 Hay diferentes tipos:
-Centrifugación.
-Filtración por membrana.
-Microfiltración.
-Ultrafiltración.
-Diafiltracion.
-Diálisis.
 Centrifugación

 Las centrifugación separa las muestras girándolas a gran

velocidad.
 A partir de este proceso, las proteínas pueden aislarse
habitualmente en una sola capa.

 El tamaño de la centrifuga determinara la cantidad de

producto que podemos obtener, una pequeña podrá procesar
unos pocos litros, mientras que una de escala industrial de
flujo continuo permite un procesamiento ininterrumpido del
extracto procedente del biorreactor.
 Filtración por
membranas

 Se pueden utilizar filtros de diferentes tipos y tamaños.

 Por ejemplo en la filtración por membrana, se utilizan finas
membranas de nylon o de otro material sintético para
eliminar todos los restos celulares de la solución.

 La microfiltración logra eliminar precipitados y bacterias.

 Y la ultrafiltración utiliza filtros que pueden capturar
moléculas como proteínas y ácidos nucleicos. Al punto que
hasta pueden separarse proteínas de distintos tamaños.
 Como positivo son mas rápidos que la centrifugación.
 Como negativo  tienden a obstruirse fácilmente.
 Diafiltracion y
diálisis Un tampón o buffer es una o
varias sustancias químicas que
afectan a la concentración de los
iones de hidrógeno (o hidronios)
 Son métodos de filtración basados en el concepto químico de
en el agua. Siendo que pH no
equilibrio  la migración de sustancias disueltas desde áreas de significa otra cosa que
mayor concentración a áreas de menor concentración. potencial de hidrogeniones (o
peso de hidrógeno), un buffer (o
 La diálisis en particular depende de la capacidad de algunas
"amortiguador") lo que hace es
moléculas de atravesar membranas semipermeables mientras regular el pH.
que otras se detienen o enlentecen por su tamaño.
 Se sustituye las sales con agentes tampón que ayudan a
estabilizar las proteínas durante el resto del proceso de
purificación.
 Es un paso necesario para eliminar aditivos utilizados en etapas
anteriores del proceso.
 La diafiltracion añade un componente de filtrado a la diálisis.
Difusión:

• Es el proceso por el cual dos soluciones de diferente

concentración, cuando se ponen en contacto, llegan a formar
una mezcla uniforme a causa del movimiento constante de
las partículas de ambas soluciones, que tienden a
distribuirse uniformemente por todo el volumen de la
solución.

Osmosis:
Principios en
• Consiste en el desplazamiento de liquido a través de una
membrana semipermeable desde el lado de mayor los que se basa
concentración al lado de menor concentración.
la dialisis
Ultrafiltración:

• Es el paso de agua y solutos producido por una diferencia de

presiones a ambos lados de la membrana. De esta forma se
favorece el paso de agua y las moléculas que la acompañan
en una u otra dirección.
 Los métodos de cromatografía nos permiten clasificar las proteínas
según su tamaño o según si tienden a adherirse a otras sustancias o
disolverse en ellas.
 Unos tubos de cristal alargados se llenan con resina y una solución
salina tamponada.

 Se añade el extracto de proteínas y fluye a través de la columna.

 Según la resina utilizada, la proteína se adhiere a las bolas de la resina
o bien atraviesa la columna, mientras que las bolas funcionan como un
sistema de filtración.
 La cromatografía por exclusión de tamaño, utiliza bolas de gel como
sistema de filtración  Las grandes moléculas proteicas viajan
rápidamente alrededor de ellas mientras que las mas pequeñas pasan
mas despacio porque pueden atravesar minúsculos agujeros que se
encuentran en las bolas de gel.

 Existen geles con distintos tamaños de poros, y su correcta elección

dependerá de los pesos moleculares de los contaminantes que hay
que separar del extracto.
 La cromatografía por intercambio iónico, se basa en la carga
electroestática (adhesión estática) para unir las proteínas a las
bolas de gel de la columna.
 Mientras que las proteínas se adhieren a la resina, otros
contaminantes atraviesan la columna y salen de ella.

 A continuación se extraen las proteínas cambiando la carga

electroestática se enjuaga la columna con soluciones salinas de
concentraciones crecientes. La proteína se libera de su adsorción y
se recoge.
  La cromatografía por afinidad, se basa en la capacidad de la
mayoría de las proteínas de unirse específica y reversiblemente a
compuestos llamados ligandos.
Los ligandos son  Una vez que las proteínas se han unido a las bolas de resina, se usa
pequeñas moléculas una solución tampón para deshacerse de las moléculas no unidas.
que se unen a una
 Por ultimo, se emplean soluciones tampón especiales para
molécula grande provocar una desorción (romper la unión de los ligandos) de las
concreta. proteínas retenidas.
 Las proteínas de fusión pueden usarse en la cromatografía por
afinidad porque el sustrato de la proteína bacteriana puede ser
parte de la columna de afinidad, atrayendo a la proteína fusionada
a la columna.
 Este tipo de cromatografía suele utilizarse en las fases finales del
proceso de purificación.
 En la cromatografía por interacción hidrófoba,
las proteínas se separan según su repulsión al
agua.

 Las bolas de la columna de este método están

cubiertas de moléculas hidrófobas, y los
aminoácidos hidrófobos de una proteína son
atraídos a las sustancias químicas similares de las
bolas de gel.
  En cada paso de la purificación es importante
verificar que no se ha perdido la proteína diana.
 Se utilizan técnicas como la electroforesis en gel de
poliacrilamida y el ensayo de inmunoabsorción ligado a
enzimas.

Verificación y  Una vez aislada y recogida la proteína diana debe

conservación guardarse de modo que su actividad se conserve hasta
que pueda utilizarse.
 Un ejemplo de como se puede conservar una proteína es
la liofilización  se congela la proteína, se usa el vacío
para acelerar la evaporación del agua del liquido (los
cristales de hielo se subliman directamente a vapor de
agua) y se sella el contenedor.
Proteínas como productos
Alimentos, medicina,
industria textil, del
cuero y del reciclaje…
todo con proteínas!
Fin…
dudas??