Enzimas

Determinación de su
actividad catalítica en
distintos materiales
biológicos
¿Qué son ?
La mayoría son proteínas
( existe ARN catalítico ).

¿ que función cumplen?

Catalizadores biológicos
Sus propiedades son….
-elevada especificidad.
-aceleran más rápido las reacciones
químicas.
-no se modifica en la catálisis.
-están sujetas a controles celulares,
genéticos y alostèricos.
-son termolábiles y sensibles a cambios
de pH.
Modelos de acción
Modelo llave y Modelo de ajuste
cerradura: rigidez. inducido: flexibilidad.
 TRABAJO PRÁCTICO

 OBJETIVO
Identificar las enzimas mediante su actividad, frente
a sustratos específicos
Preparar 3 tubos de ensayo:

Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3

Leche entera 10 ml 10 ml 10 ml
Pancreatina 1 ml 1 ml (hervida) 1 ml
Rojo Fenol 10 gotas 10 gotas 10 gotas
Incubación 37°C si si no
Sacarasa:
enzima hidrolasa
cataliza hidrólisis
de sacarosa
Extracción de sacarasa a partir de levadura
Preparar 3 tubos de ensayo:

Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3

Agua destilada 1 ml 1 ml ---

Sol. Enzima 1 ml --- 1 ml

Sacarosa 1% --- 1 ml 1 ml

Incubación 37°C 30 minutos 30 minutos 30 minutos

 sacarasa
con sacarasa
 Amilasa salival:
Hidrolasa segregada por las glándulas salivales

Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4

Saliva 1:9 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

Almidón 1% 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml

Temperatura 0°C 37°C 0°C 37°C

Tiempo 10 min. 10 min. 10 min. 10 min.

Reacción Lugol Lugol Fehling Fehling

Amilasa pancreática:
Hidrolasa liberada por el páncreas

Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4

Pancreatina 2% 1,5 ml --- 1,5 ml ---

Almidón 1% 1,5 ml 1,5 ml 1,5 ml 1,5 ml

Temperatura 37°C 37°C 37°C 37°C

Tiempo 10 min. 10 min. 10 min. 10 min.

Reacción Lugol Lugol Fehling Fehling

Transaminasas

GOT

B6
GPT
B6
GPT: glutámico pirúvico transaminasa, alanin amino transferasa o ALAT
GOT: glutámico oxalacético transaminasa, aspartato amino transferasa
o ASAT
Transaminasas

GOT GOT GPT GPT

Sustrato ml 0,5 0,5 0,5 0,5
Homog. Hervido ---- 0,5 ---- 0,5
Homog. Sin herv 0,5 -- 0,5 --
Incubar 30´ 37°C
2,4 DNFH ml 0,5 0,5 0,5 0,5
Incubar 10´ 37°C
NaOH 0,4 M ml 5 5 5 5
Cinética enzimática
El estudio de una enzima en un medio
biológico involucra 2 análisis:
1- detección de la enzima: estudio cualitativo.
2- concentración de la enzima: estudio
cuantitativo.

 Para la detección de la enzima se evalúa la

reacción química que cataliza
específicamente, observando la desaparición
de los reactivos o la aparición de los
productos.
 La cinética química estudia la velocidad de
transformación de los reactivos en productos.
 La velocidad se expresa en términos del cambio en la
concentración de sustrato o producto por unidad de tiempo

 A + B --------- C + D

 V= - dA o dC = K.[A].[B]
dt dt

La velocidad de reacción depende de:

pH
Temperatura
Concentración de reactantes.
Presión
Presencia de catalizadores: enzimas
 Unidades de Actividad enzimática:

Actividad que transforma 1 umol de sustrato por

minuto a temperatura y presión dados.

 Katal:

Transformación de 1 mol de sustrato/ seg

Ecuación de Michaelis Menten

La forma característica de la curva de saturación de la enzima por el sustrato se

expresa matemáticamente por la ecuación:

v = Vmax[S]
Km + [S]

Km concentración de sustrato
a la cual la velocidad de
reacción es ½ de su
k1 k2 velocidad máxima
E+S ES E+P
k-1
Km = k-1 + k2
k1
 En las reacciones enzimáticas en que
participan más de un sustrato, cada uno de
ellos posee su propia Km

 La Km representa una medida inversa de la

afinidad de la enzima por el sustrato.

 Cuanto mayor es el valor de Km menor será

la afinidad de la enzima por el sustrato.
La forma lineal de la ecuación de Michaelis-Menten se conoce como gráfica
de los dobles recíprocos o de Lineweaver-Burk y se utiliza para
el cálculo de los parámetros cinéticos Km y Vmáx.
Vmax[S]
v0 =
Km + [S]

1 Km + [S]
=
v0 Vmax[S]

1 Km [S]
= +
v0 Vmax[S] Vmax[S]

1 Km 1 1
= +
v0 Vmax [S] Vmax
Ecuación de Lineweaver-Burk
 Inhibición competitiva

El inhibidor y el sustrato compiten por el mismo centro

activo de la enzima
Similitud estructural con el sustrato
Al aumentar la concentración de sustrato se desplaza
al inhibidor
La velocidad máxima permanece constante
El valor de Km aumenta
 Inhibición no competitiva
Ks
E+S ES E+P
+ +
I I

Ki Ki

EI + S ESI
Ks

El inhibidor se une en un sitio diferente al sitio activo

de la enzima de manera
que se puede unir a la enzima o al complejo ES
pero en ninguno de los casos
obtendremos productos.
No se revierte por agregado de más sustrato
Objetivos del Trabajo Práctico:

 Seleccionar las condiciones para estudiar la cinética de una

reacción enzimática.

 Determinar Km y Vmax de la reacción de hidrólisis enzimática

de la sacarosa.
 La sacarasa cataliza la hidrólisis de la sacarosa en glucosa y
fructosa.

 Velocidad = se expresa como concentración de sustrato

hidrolizado por minuto.

 Para conocer la concentración de sacarosa hidrolizada

mediremos la concentración de glucosa liberada.
0,1 g de levadura + 25 ml de sol. EDTA 1%

Centrifugar homogenato 5 min. a 3.000 rpm

Sobrenadante: extracto enzimático

Tubo Enzima AcNa EDTA SACAROSA ml

(ml) (ml) (ml)

0,2 M 0,15 M 0,1 M 0,05 M 0,025 M 0,01 M
Blanco ------ 1,5 1,5 --- --- --- --- --- ---

1 0,5 1,5 --- 1 --- --- --- --- ---

2 0,5 1,5 --- --- 1 --- --- --- ---

3 0,5 1,5 --- --- --- 1 --- --- ---

4 0,5 1,5 --- --- --- --- 1 --- ---

5 0,5 1,5 --- --- --- --- --- 1 ---

6 0,5 1,5 --- --- --- --- --- --- 1

AcNa: buffer acetato de sodio 0,1 M pH 4,7

Dejar los tubos 10 minutos a 25 °C.

 A los tubos del experimento anterior y luego de la incubación:

Blanco testigo 1 2 3 4 5 6

Glucosa --- 20 ul --- --- --- --- --- ---

1g/l

Reactivo 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml
trabajo

Incubar en baño a 37°C por 15 minutos

Leer a 505 nm llevando a 0 con el blanco

Calcular concentración de glucosa en cada tubo comparando con el testigo.

 Fundamento del método
GOD
Glucosa + O2 + H2O ------------------ ácido glucónico + H2O2
POD
2 H2O2 + fenol + 4 AF ---------------- quinoneimina + 4H2O

Quinoneimina es un cromógeno rojo cereza con un pico máximo

de absorción a 505 nm.

El reactivo de trabajo es una mezcla de las enzimas GOD y POD,

4- aminofenazona y fenol en buffer fosfato pH 7.
Calcular la concentración de glucosa en cada tubo en g/l y en M.

Calcular g de glucosa en 3 ml que tiene cada tubo.

Calcular moles de glucosa

Calcular moles de glucosa / minuto

mol / min moles
Glucosa sacarosa
velocidad [S]

CALCULAR GRAFICAMENTE Km y V max

 45.000

40.000

35.000

30.000

25.000
1/V

20.000
y = 75,431x + 11,8
15.000

10.000

5.000

0.000
-0.20 -0.10 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50
1/[S]
 0.400

0.350

0.300

0.250

0.200
V

0.150

0.100 Vel., sin inhibidor

0.050 Vel., con inhibidor

0.000
0 0.05 0.1 0.15 0.2
[S]
 10

7
V

4 Vel., sin inhibidor (mmol

min-1)
3
Vel., con inhibidor (mmol
2 min-1)

0
0 5 10 15
[S]