Análise da Expressão Gênica

por Microarray
Aplicações da Tecnologia de Microarranjos de
DNA

 Expressão diferencial de genes

 Patógenos
 Drogas

 Genotipagem
Bassett et al, 1999
 Desenhando Experimentos de Microarray

Informações necessárias

 Natureza do chip  Objetivo do experimento

 Número de lâminas  Background biológico

 Massa de RNA  Tipos de amostra

 Controles  Questões específicas

 Objetivo Geral

 Avaliar diferenças na expressão de genes de

células mononucleares do sangue periférico
(PBMC) após exposição a Mycobacterium leprae,
LPS e/ou talidomida.
Hanseníase
Formas Polares de Hanseníase

RESPOSTA DOMINANTE Th1 RESPOSTA DOMINANTE Th2

Doença limitada Doença disseminada
Hanseníase Tuberculóide Hanseníase Lepromatosa
IFN-g, IL-12 IL-4, IL-5, IL-10
Baixo número de microrganismos Alto número de microrganismos
Talidomida

 1957-62
 UK, Japão Canada,
Alemanha
 Enjôo matinal
 12 mil bebês
 Desenho do Experimento

30 min - DMSO Talidomida - Talidomida - -

4h - - - LPS LPS - ML 2:1

 Desenho do Experimento

Sem estímulo x M. leprae Efeito de M. leprae

Sem estímulo x LPS Efeito do LPS

Efeito da talidomida no
LPS x LPS + Talidomida
tratamento com LPS

DMSO x Talidomida Efeito da

Talidomida
 Desenho do Experimento

M. leprae M. leprae

DMSO DMSO

Controle Talidomida Controle Talidomida

LPS LPS

LPS + Talidomida LPS + Talidomida

 Desenho do Experimento

Controle DMSO DMSO Talidomida

Talidomida LPS

LPS LPS + Talidomida

LPS + Talidomida

Talidomid LPS LPS LPS + Talidomida

a
LPS + Talidomida
 Desenho do Experimento

Controle DMSO DMSO Talidomida

Talidomida LPS

LPS LPS + Talidomida

LPS + Talidomida

Talidomid LPS LPS LPS + Talidomida

a
LPS + Talidomida
 Preparação dos alvos
Culturas tratadas /
controle

Extração de RNA total

Transcrição Reversa Marcação com Cy3 dCTP

Oligo (dT) ou Cy5 dCTP

Purificação de cDNA

Alvos prontos Hibridização por 18H a 42ºC

 Coleção de
Oligonucleotídeo
s
Conjunto de
oligonucleotídeos
humanos H10K – MWG
 Coleção de Oligonucleotídeos

H10K (MWG)
oligonucleotídeos de 9984 genes humanos

104 microplacas de 96 poços

26 microplacas de 384 poços

Liquid Handling
Coulter Beckman
Estratégia para construção dos chips de
DNA
• Número de spots
• Réplicas (ordem)
• Distância entre spots
CloneTracker 1.4 • Dimensões da lâmina, margens
• Tamanho da placa
• Número de pins
• Ordem de impressão
 Impressão de chips de DNA

SDDC - Definir:
• Número (x/y) e tipo de pin
• Número e orientação das microplacas
• Lâmina / membrana
• Distância entre spots
• Número spots/grid (x/y)
• Número de supergrids (x/y)
• Ciclos de lavagem e secagem

Robô Virtek / Bio-rad

Impressão de chips de DNA

Robô Virtek / Bio-rad

 Hibridização
Biochip Alvos

Fixação de DNA
Desnaturação

Pré-hibridização

Hibridização

Lavagem scanner
 Obtenção das imagens

 Após hibridização, os biochips são scaneados usando o Scanner Virtek, com

dois canais de leitura, 532nm (verde) e 635nm (vermelho).

Cy3 Cy5
 cDNA de PBMC x Biochip H10K

Lâminas de 1 experimento

C x DMSO C x TAL C x LPS + TAL C x LPS C x ML

cDNA de PBMC x Biochip H10K
Imagem de Microarray

65535 diferentes gradações de cinza por pixel

 Detecção da Imagem do Spot

Grid Densidade

Background
Detecção da Imagem do Spot
Análise dos dados

Spot com
qualidade
 Análise dos dados
Spot sem qualidade

B
Quantificação da Hibridização

Duncan et.al, 1999

 Análise dos Dados

 Algoritmos de análise:
spot: ativação / spot: repressão / spot: sem alteração de
expressão
-“Dados crus”: densidade do spot e Background;
- Fatores de qualidade, ex. Somatório das Medianas, Somatório
das Médias
- “Flags”
 Normalização

Fontes de Variação:

 Diferenças de incorporação dos corantes

 Diferenças na potência dos lasers

 Diferenças de massa de RNA marcada

 Ruídos espaciais na superfície do biochip

 Análise dos dados
Valores de densidade e background

Média

densidade >= (std dev)*5 VÁLIDO

densidade >= (background)*5 VÁLIDO

VÁLIDO
 Análise dos dados - Normalização
VÁLIDO

Valor médio de
Cy3
Valor mínimo background
Cy5

< mínimo > mínimo

exclusão Lowess

Diferença de 2,25X
 Normalização por Lowess

Ratio–Intensity plot showing characteristic 'banana' shape Figure 2. As in Figure 1, but corrected by lowess normalization
of cDNA ratios; log scale on both axes. (courtesy Terry Speed)
 Diferenças na expressão de genes
Gráficos são construídos a partir das razões
logarítmicas dos sinais dos genes escolhidos

3
Density(mean){Con}=3993.975

0
-4 -2 0 2 4
-1

-2

-3

-4
Density(m ean){Con}=183.53125

http://fatigo.bioinfo.cnio.es
Ontologia de Genes

 Componentes celulares

 Funções moleculares

 Processos biológicos
 Grupos Envolvidos
Lab. de Hanseniase, FIOCRUZ
Dra. Elizabeth Sampaio
Dra. Euzenir Nunes Sarno
Tatiana de Oliveira Fulco

Lab. Parasitologia Molecular, IBCCF/UFRJ

Dr. Ulisses Gazos Lopes

Unidad de Microarreglos de DNA, IFC/UNAM

Dr. Jorge Ramirez Salcedo
Lorena Chávez González

Prog. Engenharia Biomédica, COPPE/UFRJ

Dr. Flávio Fonseca Nobre