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Métodos Laboratoriais

de Diagnóstico
Utilizados em Análises
Clínicas
RADIOIMUNOENSAIO
Considerações Gerais

 Berson & Yallow (1950):


Metodologia denominada por radioimunoensaio (RIE ou RIA = Radio
Imuno Assay). Utilizava o iodo radioativo como marcador da insulina,
ou seja, determinando-se a concentração do 131I, estaria se
determinando, indiretamente, a concentração da insulina.

 RIE:
Dosagem de substâncias de difícil determinação por métodos
convencionais (espectrofotometria, eletroforese, cromatografia)
devido apresentarem em concentrações na ordem de até
picogramas/mL, como os hormônios, vitaminas e medicamentos
(Figura 02).
A

Figura 02. Método de Radioimunoensaio (RIE). A) Anticorpo monoclonal


(Ac) colocado em contato com um reagente contendo concentração padrão
de Ag marcados (Ag*) e os Ag do soro. B) Quanto maior a quantidade de Ag
presente no soro, menos Ag* estará presente no complexo Ag-Ac.
ENSAIO IMUNOABSORVENTE
LIGADO À ENZIMA
(Enzyme-linked
immunosorbent assay –
ELISA)
Considerações Gerais

 Método imunoenzimático baseado no uso de microplacas


sensibilizadas com anticorpos monoclonais que se ligam a antígenos
(hormônios, proteínas) cuja ligação é revelada pela adição de um
segundo anticorpo marcado com uma enzima capaz de reagir com um
reagente de cor específico (Figura 03).

 ELISA: utilizado em substituição aos métodos de RIE na dosagens


de hormônios e na detecção de anticorpos séricos, utilizando-se
microplacas marcadas com antígenos.
Figura 03. A) Placa contendo Ac monoclonais +
Amostra do soro contendo Ag a ser detectado (ou
vice-versa). B) Reagente contendo um segundo Ac
monoclonal (marcado com uma enzima)
específico para identificar o complexo Ag-Ac é
adicionado. C) Somente o “sanduíche”Ac-Ag-Ac-
enzima permanece ligado à placa. A adição de
reagente contendo um substrato para a enzima,
promove a revelação do “sanduíche”. D) O
cromogênio formado pode ser dosado por
espectrofotometria.
ELETROFORESE
Considerações Gerais
 Eletroforese deriva do inglês electron (a partir do grego elektron =
amarelo âmbar, que designa a propriedade elétrica das moléculas)
com o grego phoresis (ação de levar). Considerado mais um método
de separação de compostos do que um método analítico.

 Submete-se o composto orgânico (notadamente as proteínas) a


ação de uma solução tampão ácida ou básica, o que faz com que haja
a captação ou liberação de prótons da molécula do composto,
adquirindo, assim, carga elétrica positiva ou negativa,
respectivamente. Desta forma carregada positivamente ou
negativamente, a moléculas pode ser "atraída" por um pólo negativo
ou positivo, respectivamente, movimentando-se sobre o suporte onde
tenha sido aplicada (Figura 04).
A

C
D

Figura 04. Esquema de uma eletroforese. Uma fonte (A) fornece pulso elétrico
de voltagem e amperagem constantes. Uma cuba de acrílico ou plástico (B)
contém uma solução de tampão que garante a carga elétrica positiva ou
negativa da amostra. Em um suporte (C) é colocada a amostra (D) que migra
para o pólo oposto de sua carga.
Considerações Gerais

A eletroforese destaca-se como um método de


análise de proteínas e tem sua importância no
diagnóstico de várias patologias (Figura 05).
B C
A

D E

Figura 05. A) Posicionamento das proteínas plasmáticas na corrida eletroforética. B)


Padrão normal. Últimas frações correspondem aos Ac. C) Cirrose: queda da produção de
albumina e aumento de Ac de causas variadas. D) Síndrome nefrótica: grande perda
urinária de albumina; depressão imunológica conjunta com aumento da fração alfa-2. E)
Enteropatias graves: não produção de albumina é visualizada juntamente com
imunodepressão e aumento de alfa-1-globulina.
ESPECTROFOTOMETRIA
Considerações Gerais

 As radiações ionizantes eletromagnéticas com comprimento de


onda () entre 300 e 750 nm são visíveis ao olho humano (cores
distintas que compõem o espectro visível). Comprimento de onda
menor: violeta, tendendo ao vermelho com o aumento do
comprimento de onda (Figura 06). Abaixo de 300 nm (ultravioleta) e
acima de 750 nm (infravermelho) situa-se o espectro invisível para o
ser humano.

 A maioria das técnicas laboratoriais baseia-se em métodos


colorimétricos, ou seja, promove-se uma reação química específica
onde há a formação de um produto corado (cromogênio).
Raios gama 10-2
400
Raios-X
10
500
Ultravioleta
102
600
VISÍVEL
104

700
Infravermelho
106

108 800

Microondas
1010
Ondas de rádio
1012

Comprimento de onda (nm)



Fóton

Onda eletromagnética

Figura 06. O espectro visível das radiações eletromagnéticas depende


de seu comprimento de onda ().
Considerações Gerais

 Princípio básico dos métodos de quantificação por fotometria (ou


colorimetria) está em fazer incidir, sobre a solução contendo o
cromogênio, um feixe de luz de comprimento de onda complementar
específico e medir a variação entre a luz emitida, e a luz transmitida
e absorvida.

 Existe uma relação direta entre esses valores uma vez que quanto
mais corada uma solução maior a quantidade de energia luminosa
absorvida, diminuindo, proporcionalmente, a luz que é emitida.
Considerações Gerais

A relação de proporcionalidade entre esses valores, permite a


quantificação do cromogênio (e por conseguinte do composto
bioquímico que o deu origem) através da aplicação da Lei de
Lambert-Beer que permite a obtenção de valores absolutos a partir
dos valores relativos obtidos laboratorialmente.
50%
25% 75%

luz branca  = 520nm 0% 100%


ANALÓGICO
MOSTRADOR

MONOCROMADOR DETECTOR
FONTE DE LUZ Prisma
Grade de difração
CUVETA Célula fotoelétrica 7 0 DIGITAL
Filtro de cor

Figura 07. Esquema de um fotômetro. A luz monocromática incide sobre o detector


após passar pela solução contendo o cromogênio. A intensidade com que excita a
célula fotoelética reflete a quantidade de luz absorvida.
3
3
1
2

3
3

Figura 08. Esquema do comportamento da luz incidente frente à cuveta


contendo o cromogênio: 1) Luz absorvida pelo cromogênio
(representado por círculos); 2) Luz transmitida sem interferência do
cromogênio; 3) Reflexão nas faces internas e externas da cuveta.
BRANCO
Ab = 2 - log 0
Ab = 0% Ab = ?????
Ab = 2- log 100 | Ab = 0,000
 
100% T% = 0%
100% T% = 100%

Lei de Lambert -Beer :

Ab = 2 - log T
Ab = 30%
Ab = 70%
Ab = 2 - log 70 | Ab = 0,1549
Ab = 2 - log 30 | Ab = 0,5228
 
100% T% = 70%
100% T% = 30%

Figura 09. Relação entre transmitância e absorvância.


110

100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0
0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60 0,70 0,80 0,90 1,00 1,10 1,20 1,30 1,40 1,50 1,60 1,70

Figura 10. Curva de calibração de um composto bioquímico hipotético. A seta indica a zona
de linearidade da reação. Notar que há perda da linearidade em valores muito baixos e muito
elevados de concentração (Ab < 0,02 e Ab > 0,80). Este efeito é decorrente da perda de
sensibilidade do espectrofotômetro na leitura da luz transmitida.
T% Ab T% Ab T% Ab T% Ab T% Ab

100 0,000 80 0,097 60 0,222 40 0,398 20 0,699

99 0.004 79 0,102 59 0,229 39 0,409 19 0,721

98 0,009 78 0,108 58 0,236 38 0,420 18 0,745

97 0,013 77 0,114 57 0,244 37 0,432 17 0,770


Tabela 01. Tabela
96 0,018 76 0,119 56 0,252 36 0,444 16 0,796 relacionando os valores
de transmitância com a
95 0,023 75 0,125 55 0,260 35 0,456 15 0,824
absorvância
94 0,027 74 0,131 54 0,268 34 0,468 14 0,854 correspondentes.
93 0,032 73 0,137 53 0,276 33 0,481 13 0,886
Observe que o intervalo
de Ab entre 0,023 e 0,824
92 0,036 72 0,143 52 0,284 32 0,495 12 0,921 corresponde aos valores
91 0,041 71 0,149 51 0,292 31 0,509 11 0,959 de T (entre 95 e 15%)
situados dentro da faixa
90 0,046 70 0,155 50 0,301 30 0,523 10 1,000 de linearidade da reação.
89 0,051 69 0,161 49 0,310 29 0,538 9 1,046

88 0,055 68 0,167 48 0,319 28 0,553 8 1,097

87 0,060 67 0,174 47 0,328 27 0,569 7 1,155

86 0,065 66 0,180 46 0,337 26 0,585 6 1,222

85 0,071 65 0,187 45 0,347 25 0,602 5 1,301

84 0,076 64 0,194 44 0,357 24 0,620 4 1,398

83 0,081 63 0,201 43 0,366 23 0,638 3 1,523

82 0,086 62 0,208 42 0,377 22 0,658 2 1,699

81 0,092 61 0,215 41 0,387 21 0,678 1 2,000


FOTOMETRIA DE CHAMA
Considerações Gerais

 Método de dosagem de eletrólitos: Na+, K+, Li+, Mg++ e Ca++.

 Composto por um aspirador que produz pressão sobre uma amostra


diluída ou não que é automatizada em um atomizador que fornece a amostra
pulverizada p/ a câmara de combustão.

 Na câmara ocorre a excitação dos elétrons e a conseqüente emissão de


luz, que é captada por uma fenda de entrada que seleciona a luz emitida
em um filtro de cor específico para o eletrólito
(Na+ emite luz absorvida em 589 nm, K+ em 767 nm, Li+ em 761 nm).

 Detector capta e processa a luz recebida e, através da fenda de saída,


possibilita um dispositivo de leitura proceder a determinação da
concentração final.
Figura 11. Componentes essenciais de um Fotômetro de Chama.
FLUORIMETRIA
Considerações Gerais
 Luminescência: emissão de luz ou energia radiante quando um elétron
retorna de um nível de energia mais alto, ou excitado, para um nível de
energia mais baixo.

 Formas de Luminescência: Fluorescência, Fosforescência e


Quimioluminescência.

 Fluorescência: ocorre quando uma molécula absorve luz em um


comprimento de onda (excitação) e re-emite luz em um comprimento de
onda maior (emissão) = PRINCÍPIO DA FLUORIMETRIA

 Aplicação da Fluorimetria: ligação de Ag marcados e Ac (imunologia);


drogas e seus metabólitos em solução (toxicologia); zinco-protoporfirina no
sangue (hematologia); aminoácidos e enzimas (Bioquímica); mutações
gênicas (Biologia Molecular)...
Considerações Gerais
 Aparelhos para a medida de fluorescência: Fluorímetro e
Espectrofluorímetro.

 Fluorímetro: emprega filtros de interferência ou filtros de vidro


para produzir luz monocromática, para excitação da amostra e para
isolamento da emissão de fluorescência.

 Espectrofluorímetro: emprega um monocromador de prisma ou


grade para produzir luz monocromática, para excitação da amostra e
para isolamento da emissão de fluorescência.

 Componentes básicos requeridos na Fluorimetria: 1. Fonte de


Excitação; 2. Monocromador de Excitação; 3. Cubeta da Amostra; 4.
Monocromador de Emissão; 5. Detector.
Figura 12. Geometria de excitação /
emissão de fluorescência: I0 é a energia
inicial de excitação; Mex é o
monocromador de excitação; C é a
cubeta da amostra; If é a intensidade de
fluorescência; Mem é o monocromador
de emissão; D é o detector.
Figura 13. Diagrama do Espectrofluorímetro comercial típico.
CROMATOGRAFIA
Considerações Gerais
 Separação de uma mistura em seus componente individuais,
chamados de solutos. Uma separação cromatográfica requer que seja
introduzida uma amostra em um fluxo (fase móvel) de gás
(cromatografia gasosa) ou líquido (HPLC) que passa através de um
leito de partículas de suporte (fase estacionária).

 À medida que a fase móvel arrasta a amostra para dentro e através


da fase estacionária, os solutos que tiverem maior solubilidade na fase
móvel ou menor afinidade pela fase estacionária migram mais rápidos
que os outros.
Considerações Gerais

 Cromatografia plana: fase estacionária encontra-se contida ou é


acamada sobre uma superfície plana, formada por exemplo de gel de
sílica ou celulose (cromatografia em camada fina, CCF) ou formada
por papel (cromatografia em papel).
Figura 14. Cromatografia em Camada Fina: O solvente sobe pela camada fina de
material absorvente por ação capilar. A placa de CCF costuma ser corrida, deixando
que o solvente se mova em um sentido ascendente
Rf = Migração do analito /
comprimento total

Figura 15. Cromatografia em papel: perfil de aminoácidos na urina.


 Cromatografia de Aminoácidos:

Phe

Tyr

Santana da Silva, 2009 (LEIM/ICB/UFPA) Prof. Ricardo Vieira – UFPA (jrvieira@ufpa.br)


 Cromatografia de Aminoácidos:

Phe

Giugliani, 2000 (SGM/HCPA) Prof. Ricardo Vieira – UFPA (jrvieira@ufpa.br)


 Cromatografia de Glicídeos
Gal Frut Gli
Lac 1 2 Sac 3 Mal

Cromatografia de Glicídeos (paciente 1:


galactose + lactose; paciente 2: glicose +
lactose; paciente 3: galactose + frutose).

Santana
Prof. da Silva,
Ricardo Vieira2009 (LEIM/ICB/UFPA)
– UFPA (jrvieira@ufpa.br)
Condroitin sulfato

Dermatan sulfato

Heparan sulfato

1 2 3 4 5 6 7 8

Figura 16. Cromatografia em Camada Fina para Glicosaminoglicanos:


canaletas 01 e 02 indicam os controles; canaletas 03, 04, 05, 06, 07 e 08 indicam
pacientes com Mucopolissacaridose.
Figura 17. Cromatograma gasoso.
ESPECTROMETRIA DE MASSA
(MS)
Considerações Gerais
 Técnica analítica usada para identificar compostos
desconhecidos; quantificar materiais conhecidos; esclarecer
as propriedades físicas e estruturais dos íons
 O que é um espectrômetro de massa?

É um aparelho capaz de separar átomos ou moléculas


carregadas de acordo com a sua razão carga massa (m/z)

Fonte de Analisador
Entrada íons de massa Detector

Sistema de
aquisição de
dados
NOVAS TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO POR
ESPECTROMETRIA DE MASSA
ACIDEMIAS / ACIDÚRIAS ORGÂNICAS

-Aumento variável da excreção de ácidos orgânicos

- Marcadores primários, secundários, terciários


- Perfil urinário
- Análise qualitativa dos analitos presentes
- Quantificação dos principais marcadores

Prof. Ricardo Vieira – UFPA (jrvieira@ufpa.br)


NOVAS TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO POR
ESPECTROMETRIA DE MASSA
ACIDEMIAS / ACIDÚRIAS ORGÂNICAS

- Incidência coletiva de 1:15.000


- Mais comuns:
- Acidúria metil-malônica
- Acidúria propiônica
- Acidúria iso-valérica
- Acidúria 3-hidroxi-3-metil-glutárica
- Acidúria glutárica Tipo I

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Acidúrias Orgânicas por Espectrometria de Massas

Desordens metabólicas e seus respectivos marcadores

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Acidúrias Orgânicas por Espectrometria de Massas

Origem dos Ácidos Orgânicos

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Acidúrias Orgânicas por Espectrometria de Massas

Metodologias Disponíveis

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Acidúrias Orgânicas por Espectrometria de Massas

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Acidúrias Orgânicas por Espectrometria de
Massas

Vantagens :

- Rapidez
- Seletividade e especificidade
- Repetitividade
- Diagnóstico estrutural
- Flexibilidade

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Acidúrias Orgânicas por Espectrometria de
Massas

Desvantagens:

-Preço de aquisição
- Instalação complexa
- Custo de operação elevado – insumos, reagentes e
consumíveis são mais caros devido a qualidade
- Logística desafiadora -
- Exigem analistas mais qualificados e experientes

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Acidúrias Orgânicas por Espectrometria de
Massas
Análise por GC-EM

Esquema de
funcionamento
de CG-FID

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Acidúrias Orgânicas por Espectrometria de
Massas
Análise por GC-EM

Esquema de
funcionamento
de CG-FID

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Acidúrias Orgânicas por Espectrometria de
Massas
Análise por GC-EM

Esquema de
funcionamento
de CG-FID

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Acidúrias Orgânicas por Espectrometria de
Massas
Análise por GC-EM

Esquema de
funcionamento
de CG-FID

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Acidúrias Orgânicas por Espectrometria de
Massas
Análise por GC-EM

Cromatograma típico de amostra de urina – Perfil normal

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Acidúrias Orgânicas por Espectrometria de
Massas
Interferentes comuns

(TCM) - Triglicerídeosde Cadeia Média


(ácido adípico, sebácico, subérico)

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Acidúrias Orgânicas por Espectrometria de
Massas
Interpretação dos Dados Analíticos

Prof. Ricardo Vieira – UFPA (jrvieira@ufpa.br)


Interpretação

Prof. Ricardo Vieira – UFPA (jrvieira@ufpa.br)


Acidúrias Orgânicas por Espectrometria de
Massas

Ácido valpróico

Interferência devido ao uso de ácido valpróico

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Acidúrias Orgânicas por Espectrometria de
Massas
Interferentes

Ác. esteárico Plastificante

Ác. palmítico

Contaminação devido a presença de sabão


Acidúrias Orgânicas por Espectrometria de
Massas

Derivado de poliol

Contaminação com pomada


Acidúrias Orgânicas por Espectrometria de
Massas

Acidúria propiônica
Acidúrias Orgânicas por Espectrometria de
Massas

Acidúria isovalérica
Acidúrias Orgânicas por Espectrometria de
Massas

2- OH-iso-valérico

2- OH-3-metil-valérico

MSUD – Doença do Xarope de Bordo


Acidúrias Orgânicas por Espectrometria de
Massas

(13/10/2008)

Ác. 4-OH-fenilactico
Ác. 4-OH-fenilpirúvico

Ác. succinilacetoacético
Ác. 4-OH-fenilacético

Succinilacetona N-acetil-tirosina

Tirosinemia Tipo I
Acidúrias Orgânicas por Espectrometria de
Massas

Ác. feniláctico

Ác. 2-OH-fenilacético
Ác. fenilpirúvico

Ác. mandélico

Ác. Ác. 4-OH-


fenilacético feniláctico

Fenilcetonúria
Figura 18. Espectrometria de massa
Figura 18. Espectrometria de massa

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