Universidade Federal do Rio Grande do Norte

Centro de Ciências da Saúde

Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas
HPLC

Derivatização em HPLC

Jorge Luiz Diógenes Pinto

Natal/RN
2016
Plano de exposição

• Fundamentação teórica;

• Tipos de detectores;

• Grupos cromóforos;

• Conceito de derivatização;

• Derivatização pós-coluna;

• Derivatização pré-coluna;

• Artigo.
 Tipos de detectores
Fundamentação teórica

3
 Grupos cromóforos
Fundamentação teórica

“Uma molécula só absorve energia em determinada frequência se

existir uma transição de energia associada com a radiação
eletromagnética naquela frequência”

Ultravioleta (190 – 400 nm)

Visível (400 – 800 nm)

Ligações RC–CR;
Álcoois RC–OH;
Aminas RC–NH3. 4
 Conceito de Derivatização
Fundamentação teórica

A derivatização é uma reação química de modificação de

compostos a fim de gerar novos produtos com melhores
propriedades cromatográficas.

Derivatização em
Cromatografia

Pré-coluna Pós-coluna 5
Derivatização pós-coluna
6
Fundamentação teórica
 Derivatização pré-coluna
Fundamentação teórica

10

20

30

40

50

http://www.biomedicinabrasil.com/2012/10/metodos-cromatograficos.html
 AMINAS
Derivatização pré-coluna
Fundamentação teórica

O O O

R
1
C COOH +
OH
100 ºC
N + RCO + CO2
OH
NH2
O O O

H
Ninidrina N OH

8
Método colorimétrico - Stein e Moore, 1948
 AMINAS
Derivatização pré-coluna
Fundamentação teórica

O HO S

SH
+ R-NH 2 + HO
N R

O
Ortoftaldeído - OPA H
N OH

A principal vantagem que o reagente OPA apresenta em relação aos outros

reagentes derivatizantes é que este reage com aminas rapidamente e
possibilita a detecção de baixos níveis de aminas biogênicas 9
 AMINAS
Derivatização pré-coluna
Fundamentação teórica
1 2
R R
SO 2Cl N
1
R SO 2

+ HN
R
2
- HCl

N
H 3C CH3
N
H3C CH3
Cloreto de Dansila

Permitiu limites de detecção cinco vezes menores que os

conseguidos com ninidrina. Deriva aminoácidos primários e
10
secundários, porém os derivados ainda são sensíveis a luz e ao ar.
 AMINAS
Derivatização pré-coluna
Fundamentação teórica

1 O
R
HO
1 NH N 2 N
R

HN O
R
+ O
2 N
O R
NH O
N
O H2 O
N O
O
NH2 HO
6-aminoquinolil-Nsuccinimidil carbamato
- AQC
+ N

N O

Fornece limites de detecção na faixa de 50 a 300 fentomol (10-15 M). O

produto é estável podendo ser mantido por até uma semana em
11
solução aquosa e sob temperatura ambiente. A reação é também
tolerante a presença de sais e detergentes.
 AMINAS
Derivatização pré-coluna
Fundamentação teórica

O O R
O
O O
O N
NH
O
O
OH
O
O
C
+
C aminácido O
HO
HO HO
N

O-acetato-N-hidroxisuccimidil-fluoreseína -
SIFA

12
 Derivatização pré-coluna ÁLCOOIS
Fundamentação teórica

H3C H3C
I6
HO OH O OH +
HO OH OH
H+ (ClO4)- HO
O O
H
HO H
H
H + O
HO + O
HO
O

OH OH O O I7
H OH OH OH O+ CH3
H3C H3C H3C H
OH
O

O
P3 (ClO4)-
O O CH3
HO OH
O OH
O HO
H3C O
+ O
+
+
-H O
O HClO4
HO
O O H3C OH HO
O O OH O CH3 S4
CH3 OH O CH3
CH3H3C
O
O
O +
OH

As reações mais comumente utilizadas para derivatizar açúcares e seus

derivados são as reações de acetilação e de sililação. 13
 Derivatização pré-coluna ÁLCOOIS
Fundamentação teórica
3
R
N R
2
T1 R S1
T2
H B1 3
R1 CH2 R CH2 R O R
O - O
+
O
+ - +
O S Cl H N R
RCH 2 OH
+ O S S
R
2
Cl O O
Cl
I1

OH
HO OH O OH OH
HO HO
H+ (HSO4)- +
O O C O I5
H
HO H
H
H + C
HO H3C CH3 HO H

H OH OH
H3C
R2
CH3
OH OH + I4
OH O+ CH3

OH
H3C

HO OH OH
HO
OH HO OH O
HO O
O +
O HO HO
- H (HSO4)- CH3
H2SO4 + HO HO
O
+
O
OH O+ CH3 OH O
O O H +
OH2
CH3 H3C
CH3 H3C CH3
H 3C
H3C 14
O OH
H3C O
O P1
O O

H3C CH3
 Derivatização pré-coluna ÁLCOOIS
Fundamentação teórica

R3Si-X + Y-H R3Si-Y + H-Y

Reagente sililante Composto sililado

15
 Artigo
Qualis B1
FI: 2.108
16
Introdução

Artigo
• Existem numerosos compostos alifáticos nos feromônios de

insetos;

• Determinação da configuração absoluta é importante para a

atividade;

• Cromatografia é uma metodologia padrão para análise

dessas substâncias.

17
 Introdução

Artigo
Nicrophorus vespilloides
H3C
* O
C
OEt
Acetato de 4-metileptanoato
http://www.eakringbirds.com/eakri
ngbirds3/insectinfocusnicrophoru
svespilloides.htm

Oryctes elegans
CH3
* O
C
18
OH
http://m.russellipm-agriculture.com/insects/oryctes-elegans Ácido 4-metiloctanóico
 Introdução

Artigo
Tenebrio molitor

CH3
OH

4-metil-1-nonanol
http://www.uniprot.org/taxonomy/7067

19
Introdução

Artigo
Estratégia sintética

Enantiômeros de Citronelal  Enântiômeros dos feromônios

CH3
CH3
*
O
O

20
Síntese dos enantiômeros 1,2 e 3
21
Resultados e discussão
 Síntese dos enantiômeros 1,2 e 3
Resultados e discussão

CH3

Redução com LiAlH4

CH3

OH

Tosilação

CH3

OTs
22
 Síntese dos enantiômeros 1,2 e 3
Resultados e discussão
Alongamento da cadeia usando as
CH3
(R) - 6 condições de Fouquet e Schlosser, e
CH3
CH2 reagentes de Grignard na presença de
Li2CuCl4
1ª etapa EtMgBr

CH3 CH3
n-PrMgBr (R) - 7
CH2
OTs CH2 CH3
1ª etapa

1ª etapa MeMgBr

CH3
(R) - 5

CH3 23
Rendimentos de 71 – 76%
 Síntese dos enantiômeros 1,2 e 3
Resultados e discussão
CH3
2ª etapa
CH3
CH3
CH2
HO CH3
CH2
1ª etapa
O 2 - Ácido 4-metiloctanóico
CH3 CH3
1ª etapa
CH2
OTs CH2 CH3 Rendimentos de 55%
1ª etapa
2ª etapa
CH3

CH3
CH3
9
2ª etapa
HO CH2
CH2 CH3
CH3 O
8
HO Oxidação com RuCl3/NaIO4 sob
CH3 as condições relatadas por
O
Sharpless et al. 24

Rendimentos de 68 – 73%
 Síntese dos enantiômeros 1,2 e 3
Resultados e discussão

CH3
CH3 2ª etapa
CH3 HO CH3
CH2 CH2
O
1ª etapa
2 - Ácido 4-metiloctanóico
CH3 1ª etapa CH3
Rendimentos de 47%
CH2
OTs CH2 CH3

1ª etapa 2ª etapa CH3

CH3
CH3
3ª etapa HO CH2
CH3
HO CH2
CH2 CH3
CH2 CH3
O 1 - Acetato de 4-metileptanoato

2ª etapa CH3
CH 3
3ª etapa EtO
HO
CH 3
CH3
O O 3 - 4-metil-1-nonanol

Rendimentos de 47%
25
Separação dos enantiômeros 2, 3, 8 e 9
26
Resultados e discussão
 Separação dos enantiômeros 2, 3, 8 e 9
Resultados e discussão

27
Figure 2. HPLC separation of 11, 12, and 13. Column: Develosil ODS-HG3
(4.6 mm i.d. 150 mm); mobile phase: MeOH/MeCN/THF/H2O
(200:200:100:75, v/v/v/v);flow rate: 0.4 mL/min; column temp.: 20 C;
detection: fluorometry (Ex: 298, Em:460 nm); a = separation factor.
Separação dos enantiômeros 2, 3, 8 e 9
28
Resultados e discussão
Separação dos enantiômeros 2, 3, 8 e 9
29
Resultados e discussão
Separação dos enantiômeros 2, 3, 8 e 9
30
Resultados e discussão
 Artigo
Conclusão

• Foram sintetizados os três feromônios a partir do citronelal;

• Os produtos foram sintetizados com 93-97% ee;

• A separação destes enantiômeros pode ser feita a partir de

HPLC após derivatização com reagentes fluorescentes.

31
 Separação por HPLC
Metodologia

• Os derivados foram separados numa coluna de fase inversa

(Develosil ODS-HG3, 4,6 mm id @ 150 mm)

• FM: MeOH / MeCN / THF / H2O (200: 200: 100: 75, v / v / v / V)

durante 11, 12 e 13;

• MeOH / MeCN / THF (200: 200: 100, v / v / v) durante 15;

• Fluxo de 0,4 mL/min para 11, 12 e 13 ou 0,2 mL/min durante 15;

• Temperatura de coluna de -20 ºC para 11, 12 e 13 ou -59 ºC para 15.

32
• Detecção foi realizada por fluorescência a 460 nm ou 380 nm para 15.
Referências

• FRIAS, Célia Ferreira; GRAMACHO, Sílvia Alexandre  e  PINEIRO, Marta.Cromatografia

gasosa-espectrometria de massas e derivatização assistida por micro-ondas na
identificação de isômeros de glicose: uma prática para o ensino avançado em análise e
caracterização de compostos orgânicos. Quím. Nova [online]. 2014, vol.37, n.1, pp.176-
180. ISSN 0100-4042.  http://dx.doi.org/10.1590/S0100-40422014000100030

• LOPES, Eduardo da Luz. Estudo e determinação das condições experimentais da

reação de sililação utilizada na análise multirresíduos de anti-inflamatórios não-
esteroidais em matrizes aquosas ambientais por cromatografia a gás acoplada à
espectrometria de massas. 2011. 75 f. TCC (Graduação) - Curso de Química, Ufrgs,
Porto Algre, 2011. Disponível em:
<https://www.lume.ufrgs.br/bitstream/handle/10183/32777/000786995.pdf?sequence=1>.
Acesso em: 04 nov. 2016.

• PACHECO, Sidney. Melhora e implantação de metodologia de análise de alimentos

por cromatografia líquida de alta eficiêcnia. 2014. 161 f. Tese (Doutorado) - Curso de
Ciências dos Alimentos, Ufrrj, Soropédica, 2014. Disponível em:
<http://cromatografialiquida.com.br/Arquivos/TeseSidneyPacheco.pdf>. Acesso em: 04
nov. 2016.
33
Referências

• PESSOA, J. Costa. Detecção de Solutos em Cromatografia Iónica Detecção

com Sistemas Envolvendo Reacções Pós-Coluna. Técnicas Experimentais:
Química, [s.i.], v. 1, n. 57, p.38-52, jan. 1995. Disponível em:
<http://www.spq.pt/magazines/BSPQ/581/article/3000700/pdf>. Acesso em: 04
nov. 2016.

• PRESTES, Osmar D. et al.Desenvolvimento e validação de um método

analítico para a determinação de histamina em vinhos utilizando cromatografia
líquida de alta eficiência com detecção por fluorescência. Quím.
Nova [online]. 2007, vol.30, n.1, pp.18-21. ISSN 0100-4042. 
http://dx.doi.org/10.1590/S0100-40422007000100004. 

34