TECNOLOGIA DEL ADN

RECOMBINANTE
 ADN RECOMBINANTE
Se denomina ADN recombinante a
la creación de nuevas
combinaciones de segmentos o de
moléculas de ADN que no se
encuentran juntas de manera
natural.
Los procedimientos básicos para el
aislamiento de secuencias
específicas de ADN a partir de
una población de secuencias
mezcladas incluyen una serie de
pasos detallados.
ADN RECOMBINANTE
 PASO 1.ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
 Los fragmentos de ADN se generan utilizando
unas enzimas denominadas endonucleasas de
restricción o enzimas de restricción (aisladas
en bacterias), que reconocen y cortan las
moléculas de ADN en secuencias nucleotídicas
específicas.
 PASO 1.ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
LOS EXTREMOS LIBRES QUE QUEDAN SE LLAMAN EXTREMOS
PEGAJOSOS, PORQUE PUEDEN UNIRSE A OTROS FRAGMENTOS DE
ADN QUE HAYAN SIDO CORTADOS POR LA MISMA ENZIMA DE
RESTRICCIÓN
 PASO 2. VECTORES
LOS FRAGMENTOS PRODUCIDOS MEDIANTE LA DIGESTIÓN
CON ENZIMAS DE RESTRICCIÓN SE UNEN A OTRAS
MOLÉCULAS DE ADN TRANSPORTADORAS QUE SIRVEN DE
VECTORES O VEHÍCULOS DE CLONACIÓN QUE PUEDEN
LLEGAR A ENTRAR EN UNA CÉLULA HUÉSPED Y
REPLICARSE O CLONARSE.
 PASO 2. VECTORES
 Características de los vectores:
-Debe poder replicarse independientemente junto con el segmento de
ADN que transporta
- Debe contener algunos sitios de corte para enzimas de restricción,
presentes sólo una vez en el vector. Estos sitios de restricción se
cortan con una enzima de restricción y se utilizan para insertar
segmentos de ADN cortados con la misma enzima
-Debe tener algún marcador de selección para poder distinguir las
células huésped que transportan el vector de las que no lo contienen
-El vector de la célula huésped debe ser fácil de recuperar
 
 Actualmente se utilizan tres tipos principales de vectores: los

plásmidos, los bacteriófagos y los cósmicos.

PASO 2. VECTORES(plásmidos)
 Plásmidos. Moléculas de ADN circular, con un
tamaño menor que el del cromosoma. Se
replican con independencia del cromosoma
bacteriano ya que tienen su propio origen de
replicación
 PASO 2. VECTORES(plásmidos)

El gen(color azul oscuro) se inserta en un plásmido(color azul

turquesa)
El enzima de estricción previamente a cortado el gen y el
plásmido, quedando unos bordes cohesivos o pegajosos
 PASO 2. VECTORES(plásmidos)

La unión del ADN que contiene el gen que se

desea clonar con el vector de clonación, se
realiza por medio de otras enzimas,
denominadas ADN-ligasas, que unen ambos
trozos de ADN. El resultado es una molécula de
ADR RECOMBINANTE, ya que contiene
fragmentos de ADN de distinta procedencia.
 PASO 2. VECTORES(bacteriófagos)
 Bacteriófagos. El proceso es similar, se trata
de insertar el gen deseado en un fragmento de
ADN vírico. Posteriormente se ensamblarán
las distintas partes del virus. Así quedará el
virus completo
 PASO 2. VECTORES(bacteriófagos)
 Lambda (Fago λ) es un bacteriófago muy utilizado en experimentos de
ADN recombinante. Se han identificado y cartografiado todos los genes
de lambda, y se conoce toda la secuencia nucleotídica de su genoma.

El tercio central de su cromosoma es prescindible, y puede reemplazarse

por ADN exógeno sin afectar la capacidad del fago para infectar células
y formar calvas en el césped bacteriano. Se han desarrollado más de 100
vectores basados en el fago lambda, eliminando diversas porciones del
grupo génico central.

Los bacteriófagos lambda tienen dos ciclos de vida:

 Ciclo lisogénico: el DNA se integra en el genoma de la bacteria

 Ciclo lítico: el DNA se replica e incorpora en nuevas cápsides proteicas
y abandona la bacteria tras lisarla.
 PASO 2. VECTORES(bacteriófagos)

Para más información

detallada de la acción
del bacteriófago
lambda:
http://www.blackwellp
ublishing.com/trun/ar
twork/Animations/La
mbda/lambda.html
 PASO 2. VECTORES (Cósmidos)
 Cósmidos. Son plásmidos que contienen que
contienen el fragmento de ADN deseado que
posee un borde cohesivo procedente del
genoma del fago lambda (extremo cos) y se
empaqueta en el interior de un fago. Se
construye el cósmido uniendo los tres
elementos ginicos, y el resultado final es poder
introducir en la célula receptora fragmentos
largos de ADN.
PASO 2. VECTORES (Cósmidos)
 PASO 3. REPLICACIÓN
 La molécula de ADN recombinante, formada por el
vector que lleva un segmento de ADN insertado, se
transfiere a una célula huésped. Dentro de esta
célula, la molécula de ADN recombinante se
replica, produciendo docenas de copias idénticas
conocidas como “clones”. Existen varios métodos,
que dependerán del tipo de célula fundamental.

En el caso de las bacterias, se utilizan dos procesos:

La transformación y la transducción
 PASO 3. REPLICACIÓN(Transformación)
 -Transformación, ocurre de forma espontanea
en ciertos tipos de bacterias y se consigue
artificialmente sometiendo a la célula
bacteriana a tratamientos físicos y químicos.
La célula capta moléculas de ADN que se
encuentran en el medio externo, las introduce
en su interior y las incorpora a su genoma.
PASO 3. REPLICACIÓN(Transformación)
 PASO 3. REPLICACIÓN (Transducción)
 Transducción, Este método consiste en
introducir el ADN en la célula hospedadora
mediante un virus, utilizando como vector de
clonación el genoma del virus.
 PASO 3. REPLICACIÓN (Transducción)

El número 1 corresponde al virus

aproximándose a una bacteria. Se
puede observar cómo lleva un
genoma ya con el gen que interesa
clonar. El siguiente momento 2,
corresponde al contacto entre el virus
y la pared bacteriana, en cuya zona de
contacto se produce un poro por
donde como vemos en la etapa 3, el
virus inyecta su ADN al interior de la
célula bacteriana.
 ADN RECOMBINANTE
 Todos los pasos vistos hasta ahora se resumen
de forma visual en el siguiente video:

http://www.youtube.com/watch?v=_Q0ScibrEns
&feature=related
 PASO 3. REPLICACIÓN (PCR)
 Actualmente se emplea la técnica de la PCR, desarrollada por Kary Mullis
en 1980, (Reacción en Cadena de la Polimerasa) con la que se puede
generar centenares de miles de copias de una secuencia sin la necesidad
de clonarla en ningún tipo de vector.

 Esta se basa en la separación de ambas hebras de ADN, la posterior unión

de pequeños fragmentos (denominados primers) y la extensión de estos
fragmentos usando de molde el ADN de la muestra. Así se obtienen dos
copias idénticas por cada molécula en cada ciclo de reacción. Para llevar a
cabo esta reacción se requiere de una enzima polimerasa que sea capaz de
soportar la alta temperatura del proceso de desnaturalización. Esta enzima
es una ADN-polimerasa especial obtenida de una bacteria termófila (la
Thermus aquaticus), resistente a altas temperaturas.
PASO 3. REPLICACIÓN (PCR)
 PASO 4. IDENTIFICACIÓN
 Potencialmente, el ADN clonado puede
transcribirse, su ARNm puede
traducirse, y el producto génico puede
aislarse y examinarse, e incluso
mediante sondas localizar genes o
proteínas.

 Las sondas son fragmentos de ADN o

ARN de simple cadena complementarias
a la región de ADN o ARN que
queremos encontrar. Contienen alguna
"marca" que permite revelar su unión
(hibridación) a la secuencia elegida y de
esa manera revela presencia de la región
buscada.
 PASO 4. IDENTIFICACIÓN(Electrolisis)
 Otra forma para la identificación de
ADN, ARN y proteínas es la
electroforesis en gel. Método más
utilizado en laboratorio para separar
ácidos nucleicos o proteínas, de
acuerdo con su tamaño.

Esto se logra por la diferencia de

desplazamiento de las moléculas a lo
largo de un gel sometido a un campo
eléctrico. La carga eléctrica sirve
como fuerza impulsora que atrae las
moléculas cargadas negativamente
hacia el otro extremo del gel que
posee carga positiva. Existen distintos
tipos de gel; comúnmente se utiliza
agarosa o poliacrilamida.
 PASO 4. IDENTIFICACIÓN(Electrolisis)
 En los ácidos nucleídos la dirección de migración es del electrodo
negativo al positivo, y esto es debido a la carga negativa presente en el
esqueleto azúcar-fosfato. En los fragmentos de ADN dobles (con
estructura de doble hélice) la velocidad de migración es inversamente
proporcional a su tamaño. En fragmentos simples de ADN y ARN (una
sola cadena), dichas moléculas tienden a plegarse de forma compleja y
a migrar de forma más complicada, según la estructura terciaria
formada tras el plegamiento. Sin embargo, compuestos que puedan
romper los enlaces de puente de hidrógeno, como el hidróxido de
sodio o la formamida, son empleados para 'desplegar' las moléculas
plegadas y permitir que la velocidad de migración dependa únicamente
del tamaño y no de la estructura formada tras el plegamiento.
 http://www.youtube.com/watch?v=6vKLT5mQoBM
PASO 4. IDENTIFICACIÓN(Electrolisis)
 PASO 4. IDENTIFICACIÓN(Electrolisis)
 Por otra parte, las proteínas no tienen una estructura predecible como los
ácidos nucleídos, y por tanto sus velocidades de migración no son similares
entre ellas. Incluso puede que no migren ni al aplicar una fuerza
electromotriz(al encontrarse en su punto isoeléctrico). En estos casos, las
proteínas se desnaturalizan mediante la adición de un detergente y un agente
reductor. Los detergentes otorgan una carga neta negativa a la proteína que les
permite migrar a través del gel de poliacrilamida en relación directa a su
masa, ya que la cantidad de cargas negativas que se unen a la proteína
depende del tamaño de ésta, existiendo una relación carga/masa similar. Por
otro lado, el agente reductor rompe los enlaces disulfuros, separando a la
proteína en sus sub-unidades. Además, la desnaturalización hace que pierdan
su estructura terciaria y cuaternaria por tanto su velocidad de migración es
proporcional al tamaño y no a su estructura terciaria ni a su interacción con
otras macromoléculas. Así, los más grandes se desplazan más lentamente.
PASO 4. IDENTIFICACIÓN(Electrolisis)
TANIA ANTELO FORMOSO
LACC2
2010-2011
FEBRERO