PURIFICAÇÃO DE INIBIDORES DE

PROTEASES EXTRAÍDOS DE
SEMENTE DE Acacia plumosa Lowe
Acadêmicos: Charles Antônio Ortúnio
Juliana Arruda Varela
Mayke Cézar Wippel
Professora: Lisiane Fernandes de Carvalho
Disciplina: Engenharia Bioquímica II
INTRODUÇÃO
Figura 1. A. plumosa L..
Sementes de plantas pertencentes à família Leguminose são
excelentes fontes de inibidores de proteases. O gênero Acacia
(Figura 1) é um dos membros mais importantes deste grupo. Neste
trabalho vamos apresentar sobre:

 Famílias de Inibidores de proteases;

 O gênero Acacia;
 Purificação do Inibidor;
 Resultados encontrados.

Fonte: FARMACOGNOSIA, 2015.

Proteases
 Enzimas proteolíticas catalisadoras;
 2% do genoma humano e participam de vários processos fisiológicos;
 Essenciais em vírus, bactérias e parasitas;
 Classificação em classes;
 Cisteinoproteases;
 Asparticoproteases;
 Metaloproteases;
 Serinoproteases;
Inibidores de Proteases
 Proteólise descontrolada;
 Controle da atividade proteolítica;
 Proteção de fluidos e tecidos;
 Inibidores naturais ou proteicos;
 Terapia anti-retroviral;
 Categorias;
Inibidores de Serinoproteases
 Inibição estritamente competitiva; Figura 2. Tripsina

 Distribuídos entre animais, plantas e microrganismos;

 Distinção entre as famílias de plantas;
 Browman-Birk, Kunitz, Batata I, Batata II e Abóbora;

Fonte: WIKIBOOKS, 2015.

Família Bowman-Birk Figura 3. Feijão Verde.

 Caracterização;
 Complexos estequiométricos.

Fonte: BENEFÍCIOS NATURAIS, 2015.

Família Batata I e Batata II Figura 4. Batata Inglesa e tomate.

 Família Batata I;
 Família Batata II.

Fonte: METALURGICOSCSUL, 2015.

Família Abóbora
 Menores inibidores conhecidos;
 Inibição muito potente;
Figura 5. Abóbora
 Três pontes dissulfeto.

Fonte: ULTRADOWNLOADS, 2015.

Família Kunitz
Figura 6. Guapuruvu.
 170 a 200 resíduos de aminoácidos;
 Estrutura primária composta por uma única
cadeia;
 Uma das mais importantes famílias de inibidores
de proteases;
 Encontrados em todas as partes de plantas;

Fonte: WORLDMAPZ, 2015.

 Inibidores de proteases na família
Leguminosae
 Família de grande importância para o homem;
 Processos biológicos;
 Processos fisiológicos.
Figura 7. Calliandra. Figura 8. Sappanwood. Figura 9. Neotropical L.

Fonte: HDIMAGEGALLERY, 2015. Fonte: WIKIMEDIA, 2015. Fonte: KEW, 2015.

O gênero Acacia
 Atividades biológicas;
 Inibidor AcTI.

A espécie Acacia plumosa Lowe

 Caracterísitcas;
 Locais frequentes;
 Utilização.
 Obtenção do extrato bruto
Sementes de A.
plumosa
• Seleção
• Separação do cotilédone
• Maceração em almofariz

Farinha
• Descartado • Adição de PBS ph 7,4 com 0,1 M de
NaCl
• 2 hrs em agitação 4°C
• Centrifugação 10000 rpm, 30 min, 4°C

Precipitado Sobrenadante
• Filtrado em papel filtro
• Diálise contra PBS por 1
Extrato Bruto dia
Purificação do Inibidor
Cromatografia de Exclusão Molecular
 As frações eluídas da filtração molecular foram coletadas, dialisadas e filtradas em centripred-3 para
serem testadas quanto à capacidade de inibição da coagulação sanguínea e inibição da atividade de
tripsina.

Cromatografia de Troca Iônica

 Todas as frações que correspondiam a um pico de absorbância em 280nm foram dialoconcentradas e
empregadas em ensaios de inibição da coagulação sanguínea e de inibição da atividade de tripsina.
Purificação do Inibidor
Eletroforce em Gel de Poliacrilamida
 A presença das bandas protéicas foi detectada com a imersão dos géis numa solução de corante por
15min sob agitação branda. Em seguida, os géis foram descorados em ácido acético 7%.

Cromatografia de Fase Reversa

 Esta etapa cromatográfica foi utilizada para separar as cadeias dos inibidores após serem submetidos às
reações de redução e de alquilação.
Purificação do Inibidor
Determinação de proteínas totais do extrato bruto e quantificação dos inibidores
 Realizada pelo método de Lowry, cuja reação colorimétrica envolve a oxidação dos aminoácidos
aromáticos da proteína com o reagente de fenol; a oxidação é catalisada por cobre em meio alcalino.

A quantificação dos inibidores após purificação foi feita por meio da determinação experimental do
coeficiente de extinção molar.
 Figura 10. Mono e Dicotiledônea.

Resultados
• Obtenção do Extrato Bruto (EB):

• 2 g do pó de cotilédones
• Centrifugação 10.000 rpm • Volume de 17 mL de EB
• 20 mL de PBS
• Separação do sobrenadante • Diálise
• Agitação por 2 hrs a 4°C

• Ensaios de inibição sanguínea • Presença de atividades

e da ação enzimática da anticoagulantes e de inibição da
tripsina ação da tripsina Fonte: WIKIPÉDIA, 2015.
 Resultados
• Purificação do inibidor – Cromatografia de Exclusão Nuclear
Figura 11. Esquema de Funcionamento.
• A fase estacionária (matriz) consiste num
gel com poros de diferentes tamanhos;
• Proteínas de menor massa percorrem o
caminhos dos poros;
• Separa as moléculas de diferentes
tamanhos;
• Resida utilizada: Sephadex ou superdex
(polímero de glicose);
• As proteínas maiores são “excluídas”
saindo primeiro na coluna.

Fonte: PROTEÔMICA, 2015.

 Resultados
• Purificação do inibidor – Cromatografia de Exclusão Nuclear
Figura 12. CEN do EB de A. plumosa.

• Somente três frações tiveram

capacidade de inibição da
coagulação e ação enzimática.

• Inseridas no sistema de
cromatografia de alta e baixa
pressão ÄKTA purifier system.

Fonte: LOPES, 2006.

Resultados
Figura 13. CTI do ApPIII.

• Purificação do inibidor – Cromatografia

de Exclusão Nuclear

• Após a separação da fração ApPIII, esta

foi dialisada contra solução tampão de
Acetato de Sódio 50 mM (pH 5,0) para
então ser submetida a uma Peso Molecular
cromatografia de troca iônica. de: 20kDa

Fonte: LOPES, 2006.

 Figura 14. Funcionamento de CTI.

Resultados
• Cromatografia de Troca Iônica – CTI

• Proteínas com a mesma carga da

resina/líquido saem primeiro da coluna;
• Moléculas carregadas ligam-se a grupos de
carga oposta que situam-se na matriz;
• Para remover as proteínas que se ligaram à
matriz deve-se alterar as características do
meio.

Fonte: PROTEÔMICA, 2015.

Resultados Figura 15. Cromatógrafo Líquido – FPLC
ÄKTA16.
Figura Purifier – EM
CTI para e TI. ApPIII
amostra
• Cromatografia de Troca iônica – CTI

• A amostra ApPIII foi aplicada em coluna

Mono-S (eluente de Acetato de sódio
50mM, pH 5,0)onde revelou 6 picos
majoritários, no entanto as atividades
anticoagulante e de inibição da tripsina
foram detectadas em apenas 4 delas.
• Solução de NaCl durante 50 min. Foram
coletadas 0,5 mL para teste.

Fonte: LOPES,
Fonte:2006.
LACTAD, 2015.
 Resultados
• Eletroforese em Gel de Poliacrilamida:
• É uma técnica analítica utilizada na análise de  macromoléculas como proteínas e ácidos nucléicos.
Figura 18. Equipamento para
Figura 17. Funcionamento da eletroforese. Eletroforese

Fonte: CENTROCIÊNIAJÚNIOR, 2015. Fonte: ANALÍTICA, 2015.

 Resultados Através deste método concluiu-se que existem 4
diferentes isoformas deste inibidor

• Eletroforese em Gel de SDS-PAGE:

• As frações provenientes das etapas de cromatografia foram submetidas a eletroforese, sendo corado com
Coomassie Blue R250 como mostra a Figura 8.
Figura 19. Amostra de ApPIII. Figura 20. Frações ApTIA,B,C e D.

Fonte: LOPES, 2006. Fonte: LOPES, 2006.

Resultados
• Cromatografia de Interação Hidrofóbica Figura 21. Cromatógrafo HPLC.

• A separação ocorre por diferença de hidrofobicidade

entre a proteína e a fase ligada, normalmente C4, C8 ou
C18, neste experimento utilizou-se C18.
• Utilizada no estágio final de purificação de peptídeos e
oligonucleotídeos.

• As frações obtidas no CTI, foram inseridas no

cromatógrafo HPLC, conforme Figura 10.

Fonte: TRACES CENTRE, 2015.

 Resultados
• Cromatografia de Interação Hidrofóbica

Figura 23.
22. Tempo de retenção das amostras A
C e B.
D.

O tempo de retenção foi de 27

26 minutos,
o que corresponde uma hidrofobicidade
de 55%.
52%.

Fonte: LOPES, 2006.

Resultados
• O volume de 17 mL apresentava uma massa de proteínas totais de 130mg. Dentro destas proteínas, cerca
de 8,5 mg correspondiam aos inibidores, distribuídos na forma de:

• 2 mg de ApTIA;
• 2 mg de ApTIB;
• 3,5 mg de ApTIC; Correspondem a quantidade das
isoformas dos inibidores
• 1 mg de ApTID.

Fonte: LOPES, 2006.

Conclusão
• Os bioprodutos ocupam uma posição central na sociedade atual, pois seu estudo tem se intensificado na
produção de fármacos, cosméticos, enzimas, vacinas e entre outros. A obtenção destes produtos
normalmente é realizada por processos de bioconversão, síntese bioquímica ou ainda por extração de
fontes naturais, que geram inúmeros subprodutos, e por isso necessitam de etapas de purificação, para
isolar e caracterizar o produto final.
• O estudo dirigido nesta dissertação, mostrou diferentes técnicas de purificação que dificilmente
aprendemos durante a graduação, mas que desempenham funções importantes, quando se diz respeito a
técnicas de purificação.
• Por isso conclui-se que conhecer diferentes equipamentos e técnicas de purificação é um diferencial na
carreira do Engenheiro Químico.
Referências
• ANALÍTICA. Equipamento para eletroforese. Disponível em: http://www.analiticaweb.com.br/produtos_detalhe.php?
tit=cuba-eletroforese-western-blotting-southern-blotting-northern-blotting-blotting-proteinas-dna-rna-membranas-nylon-
nitrocelulose-pvdf&Bid=p4d2edd57ed1e4&an=f56ae06773eb563192030564f6ed7cfe. Acesso em: 21 jun. 2015.
• BENEFÍCIOS NATURAIS. Feijão Verde. Disponível em: http://beneficiosnaturais.com.br/feijao-verde-beneficios-e-
propriedade/. Acesso em: 21 jun. 2015.
• CENTRO DE CIÊNCIAS JÚNIOR. SDS-PAGE. Disponível em:
http://www.centrocienciajunior.com/miudos_graudos/vamosfalar01.asp?id=810. Acesso em: 21 jun. 2015.
• FARMACOGNOSIA. Acacia plumosa Lowe. Disponível em: http://www.farmacognosia.ufms.br/pltinv1/acaciaplum1b.htm.
Acesso em: 21 jun. 2015.
• HDIMAGEGALLERY. Calliandra haematocephala pink powder puff. Disponível em:
http://hdimagegallery.Net/calliandra+haematocephala+pink+powder+puff. Acesso em: 21 jun. 2015.
• KEW. Neotropical Leguminosae (Papilionoideae). Disponível em:
http://www.kew.org/science/tropamerica/neotropikey/families/Leguminosae_(Papilionoideae).htm. Acesso em: 21. jun. 2015.
• LACTAD. Cromatógrafo Líquido – FPLC AKTA Purifier (GE). Disponível em: http://www.lactad.unicamp.br/?
page_id=464. Acesso em: 21 jun. 2015.
Referências
• LOPES, José Luiz de Souza. Purificação e Investigação das Propriedades Físicos-Químicas de Inibidores de Proteases Extraídos de Sementes
de Acacia plumosa Lowe. 2006. 91 f. Dissertação (Mestrado) - Curso de Física, Física Aplicada - Física Biomolecular, Universidade de São Paulo,
São Carlos, 2006. Disponível em: <www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76132/tde.../JoseLopes.pdf>. Acesso em: 19 jun. 2015.
• METALURGICOSCSUL. Preço da batata e tomate sobe quase 15% no ABC. Disponível em:
http://www.metalurgicoscsul.org.br/index.php/noticias/item/517-preco-da-batata-e-tomate-sobe-quase-15-no-abc. Acesso em: 21 jun. 2015.
• PROTEÔMICA. Cromatografia. Disponivel em: http://slideplayer.com.br/slide/289119/. Acesso em: 21 jun. 2015.
• TRACES CENTES. Teaching and Research in Analytical Chemical and Enviromental Science. Disponível em:
http://www.utsc.utoronto.ca/~traceslab/. Acesso em: 21 un. 2015.
• ULTRADOWNLOADS. Abóbora Sorridente. Disponível em: http://ultradownloads.com.br/papel-de-parede/Halloween--58142/. Acesso em: 21
jun. 2015.
• WIKIBOOKS. Structural Biochemistry/Enzyme Catalytic Mechanism/Proteases. Disponível em:
https://en.wikibooks.org/wiki/Structural_Biochemistry/Enzyme_Catalytic_Mechanism/Proteases. Acesso em: 21 jun. 2015.
• WIKIPÉDIA. Cotilédone. Disponível: https://pt.wikipedia.org/wiki/Cotil%C3%A9done. Acesso: 21 jun. 2015.
• WIKIMÉDIA. Caesalpinia sappan. Disponível em:
https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Caesalpinia_sappan_(Sappan_wood)_W3_IMG_3339.jpg. Acesso em: 21 jun. 2015.
• WORLDMAPZ. Guapuruvu. Disponível em: http://br.worldmapz.com/photo/128212_ko.htm. Acesso em:21 jun. 2015.