3.

Fabriquer une banque

d’ADN
 3. Fabriquer une banque d’ADN

L’ensemble des clones obtenus s’appelle une « banque d’ADN »

Les banques d’ADN sont classées selon :

 le vecteur utilisé pour la fabriquer

 l’origine de l’ADN
3.1. Les banques d’ADN génomique
 3.2. Les banques d’ADNc

Définition :

ADN "complémentaire » :
copie ADN d'un ARN

 copie dépourvue des

introns (séquences non
codantes du gène)
4. Identifier un gène
spécifique
 4.1. Utilisation de sondes

 Le terme utilisé pour identifier un clone est « criblage ».

Sonde :

 petit morceau d’ADN synthétisé dont la séquence correspond

au moins en partie à celle d'un des brins du fragment d’ADN que
l’on veut identifier

 complémentaire de l'autre brin de l’ADN

 capable de se fixer spécifiquement sur l'autre brin

4.1. Utilisation de sondes
 4.2. Identification directe des clones par hybridation

 utilisation d’une sonde marquée

(ex : radioactivité)

 révélation par autoradiographie

 4.3. Analyse de l’ADN cloné par séquençage

Définition :

 Le séquençage de l’ADN est la détermination de la succession

des nucléotides le composant.

 Technique de routine en laboratoire

 Technique basée sur le mécanisme de réplication de l’ADN

 4.3.1. La méthode de Maxam et Gilbert

un tube par type de coupure (une

après G, après A, après T, après
C).

En fonction des concentrations

d’enzyme et d’ADN, on obtient une
coupure par molécule avec tous les
cas différents présents.
 4.3.2. La méthode de Sanger

 synthèse d’ADN avec des arrêts

de synthèse, en utilisant des
didésoxynucléotides (ddNTP)

 chaque tube contient donc en fin

de réaction une population de
fragments de taille variable, ayant
tous la même extrémité 5’ et se
terminant tous en 3’ par le même
ddNTP à toutes les positions
possibles.
 4.4. Analyse par des techniques de transfert
4.4.1. Le southern blot

 Digestion de l’ADN par les enzymes de restriction

 Séparation des fragments par électrophorèse

 Dépôt d’une membrane absorbante sur le

gel

 Les bandes d’ADN sont absorbées par

capillarité

 Immersion de la membrane dans une

solution contenant la sonde marquée

 Révélation par autoradiographie

 4.4.2. Autres techniques de transfert

Northem blot :

 Mélange d’ARN séparé dans un gel

 Transfert sur une membrane

 Criblage par une sonde marquée

Principale application :

 déterminer si un gène est transcrit dans un tissu donné

ou dans certaines conditions expérimentales.
 4.4.2. Autres techniques de transfert

Western blot :

 Mélange de protéines séparées dans un gel

 Transfert sur une membrane

 Criblage par une sonde marquée

= anticorps marqués dirigés contre la protéine à identifier
IV. Ingénierie génétique des
plantes
 1. Principe de la manipulation génétique

 Étape 1 : Choix du gène et introduction du gène dans un vecteur

 Étape 2 : Introduction du plasmide recombiné dans la bactérie

 Étape 3 : Sélection des cellules transformées

 Étape 4 : Transfert du gène dans la plante

 Méthode de transfert direct (chimique, physique…)

 Méthode de transfert indirect (Agrobactéries)

 Étape 5 : Régénération de la plante

2. Les méthodes de transfert indirect de gènes

Plusieurs souches d’agrobactéries dont les plus connues sont :

 Agrobactérium rhizogenes qui héberge le plasmide Ri

= responsable du « chevelu racinaire »
= développement anormal des racines

 Agrobactérium tumefaciens qui héberge le plasmide Ti

 2.1. Agrobacterium tumefaciens

Bactérie du sol : responsable de la galle du collet

Agrobacterium tumefaciens

 Région du collet (= zone de liaison entre la tige et la racine)

 2.1.1. La galle du collet

 développement anarchique des tissus à l’emplacement d’une blessure

 galle du collet apparenté à un « cancer végétal »

 Nécrose de la partie aérienne et mort de la plante

 2.1.1. La galle du collet

Cellules de la tumeur fabrique des molécules : les opines

 molécules jamais présentes dans les plantes saines

 substances nutritives pour les agrobactéries

 activent la multiplication des bactéries

 synthèse d’opines détourne les voies du métabolisme normal de

la plante
 2.1.1. La galle du collet

 Déviation du métabolisme de ces plantes =

Opération de « génie génétique naturelle »

 Responsables :
Les agrobactéries et leur grands plasmides de 200 kb

 Exemple : le plasmide Ti
 2.1.2. Le plasmide Ti

 Ce plasmide est utilisé de façon routinière pour produire des

plantes transgéniques.

 nommé Ti pour Tumor inducing

 responsable de la virulence d'Agrobacterium tumefaciens

 Carte simplifiée du plasmide Ti

ORI : Origine de réplication

OCC : zone de dégradation des opines par

la bactérie

ADN-T : partie transférée et s’exprimant

uniquement dans la cellule végétale

• limitée par deux bordures dites « droites

et gauches »

• renferme une fonction ONC responsable

de la prolifération

• renferme une fonction OPS responsable

de la synthèse des opines
Taille : 200 kb
 Carte simplifiée du plasmide Ti

Zone vir : fonction de virulence,

responsable du transfert de l’ADN-T

 sa capacité à reconnaître des cellules

végétales

 à les infecter

 à transférer de l’ADN-T jusqu’au noyau

 à intégrer cet ADN-T au génome de

Taille : 200 kb
la cellule végétale
2.1.3. Transfert de l’ADN dans les cellules végétales

 L’intégration de l’ADN-T au génome de la cellule végétale

responsable =

 de la formation de tumeur
 de la sécrétion des opines

 Pour introduire des gènes nouveaux =

Utilisation de la région-T d’un plasmide Ti désarmé (ne contient

plus les gènes responsables de la tumeur)
2.1.3. Transfert de l’ADN dans les cellules végétales

 Les plasmides Ti =

 pas de sites uniques de restriction permettant le clonage

direct de l’ADN

 Avant d’être transmis à Agrobacterium =

 gène à transférer doit être introduit dans un vecteur

(ex : plasmide)
 a. Transfert de l’ADN par co-intégration

 transfert d’un gène d’intérêt dans un plasmide

d’E.coli

 ce plasmide est appelé « intermédiaire »

 le plasmide est transféré dans Agrobacterium

comportant un plasmide désarmé

 présence de séquence homologue permet la

recombinaison des deux plasmides

 formation d’un grand plasmide Ti

 b. Transfert de l’ADN par vecteur binaire

 construction d’un vecteur intermédiaire :

 Bordure gauche et droite du plasmide Ti
 Le gène d’intérêt + gène de résistance à
antibiotique

 le plasmide est transféré dans Agrobacterium

comportant un plasmide désarmé

 pas de séquence homologue donc pas de

recombinaison des deux plasmides

 quand Agrobacterium parasite la cellule, elle

ne transmet que le plasmide intermédiaire
 3. Les méthodes de transfert direct de gènes

Techniques alternatives aux agrobactéries

 difficile d’introduire de l’ADN dans des cellules végétales (paroi

cellulosique)

 traitement des parois avec des cellulases

 obtient des protoplastes seulement entourés d’une membrane
plasmique

Protoplaste : cellule végétale artificiellement débarrassée de sa

membrane cellulosique rigide, garde ses structures essentielles et son
métabolisme
 3.1. Transformation chimique

 Mise en contact avec certains sels :

CaCl2, le CaPO4, les sels de lithium …

 les cellules deviennent

compétentes :

 elles absorbent l’ADN

situé dans le milieu extérieur
 3.1. Transformation chimique

PEG ou polyéthylène glycol

 agit en présence de Ca2+ ou Mg2+

 déstabilise la membrane des protoplastes
 facilite la pénétration de l’ADN

 efficacité de la transformation exprimée en :

nombre de transformants par µg d’ADN.
 3.2. Transformation électrique : électroporation

 soumettre un mélange de protoplastes et d’ADN à des

chocs électriques (200 à 1000 volts/cm pendant quelques
millisecondes max)
 déstabilise la membrane plasmique
 induit la formation de pores à travers lesquels l’ADN peut
transiter

Avantages  :

 Plus efficace et plus rapide.

 Pas besoin de cellules compétentes.
 Nombreuses espèces transformées par cette technique
 3.3. La micro-injection

 fines pipettes en verre (capillaires étirés)

 un microscope inversé

 permet l’injection d’une solution d’ADN dans le noyau

 inconvénient : traitement cellule par cellule

 3.4. La biolistique

 bombarder à haute vitesse des microparticules de tungstène

(1µ de diamètre) enrobées d’ADN

 ADN se réhydrate et peut diffuser

 Si la bille a atteint le noyau :

possibilité d’intégration de l’ADN
dans le génome.
 3.5. L’agrolistique

 dérivée de la biolistique associée à la transformation indirecte

par les agrobactéries

 provoque des microblessures dans les tissus

 envahir avec plus de facilité et de vigueur

 augmenter le rendement de la transformation
 4. Conclusions sur les méthodes de transferts

 grande batterie de techniques de transformation génétique

 facteur limitant : techniques de régénération in vitro

 problème : présence de gènes marqueurs utilisés

(gènes de résistances à des produits chimiques ou antibiotiques)
 5. La régénération des plantes à partir de cellules

 régénérer une plante entière à l’aide de ces cellules transformées

 mises dans un milieu de culture (hormones de

croissance : des auxines et des cytokines)

 apparition de petites pousses

 transfert dans un nouveau milieu de culture permettant le

développement des racines

 quand racines suffisamment développées : les plantules sont

repiquées
6. Confirmation de la nature transformée des plantes
 7. Applications médicales

7.1. Exemple du tabac transgénique

 plants de tabac pour fabriquer des protéines

Ex : hémoglobine humaine

 transfert des gènes de l'hémoglobine humaine dans un plant

de tabac

 2 gènes interviennent dans la synthèse de l’hémoglobine

humaine.
7.1. Exemple du tabac transgénique
 7.1. Exemple du tabac transgénique

Technique de l'électrophorèse

 permet de repérer les allèles

(gènes) dont l'expression donne les
molécules recherchées
7.2. Autres applications médicales
 8. Autres applications
8.1. La protection des cultures

8.1.1. La résistance des plantes aux insectes

Problèmes liés aux herbicides

 nuisible à l'environnement
 populations d'insectes « résistants » 
 parfois inefficaces, suivant le stade de développement de
l'insecte

 Faire synthétiser aux plantes des protéines toxiques pour les

insectes
 8.1.2. La tolérance des plantes aux herbicides

 Plante de culture " tolérante " aux herbicides

 Éliminer les plantes sauvages indésirables

 Introduction d'un " gène de tolérance " dans son génome

 L'expression du gène empêche la substance active de

détruire la plante.

 soja, betterave, laitue, melon, pomme de terre, blé,

colza, tournesol...
 8.1.3. La résistance aux maladies

 virus
 champignons
 bactéries phytophathogènes

 Éviter des pertes de rendements

 pomme de terre, melon, concombre, betterave, tomate...

8.1.4. La résistance aux conditions climatiques

Espèces résistantes :

 au froid
 à la sécheresse
 à la salinité…

 intérêt pour les pays en développement

 8.2. Applications industrielles

 Peuvent produire par exemple :

 des élastomères

 des plastiques biodégradables

Ex: le polyhydroxybutyrate (PHB)
 8.3. Technique de dépollution

 dépollution des sols pollués

Plantes utilisées comme agents bio-indicateurs

Ex : tabac utilisé pour évaluer le degré de pollution par l'ozone (zones

nécrotiques sur les feuilles)

«biocapteurs» : capacité de piéger de grandes quantités de polluants :

Ex : métaux lourds et autres éléments indésirables dans les sols

(ammonium, mercure, césium, arsenic…)

 Extraction des toxiques après calcination et réductions des cendres