Introdução a Métodos

Cromatográficos
Geverson de Andrade Teixeira¹
Juliane Menegon Macan²
Reginaldo Geremias³

Acadêmico do curso de ciências biológicas¹ - UNESC

Acadêmica do curso de Farmácia² - UNESC
Professor-orientador³ - GPGIA/UNESC
 Introdução
Histórico:

- Inicio-se a partir de 1906, experimentos em

cromatografia.
- Método realizado foi separar extratos de folhas e gema
de ovo, em colunas de vidro recheados com sólidos, em
meio de éter.
- Atualmente o processo resulta em varias etapas de
separação de misturas, conforme a sua técnica e
finalidade de aplicação.
A Cromatografia propriamente dita
Segundo Collins (1997) a cromatografia é um método
físico-químico de separação dos componentes de uma mistura,
realizada através da distribuição destes componentes entre duas
fases, que estão em contato íntimo.

Fase Estacionária Fase Móvel

Meio
(tampão)

Substâncias
Mistura separadas
(c/ Eluente)
Caracterização da cromatografia

O processo de cromatografia procura separar, identificar e

quantificar espécies químicas como proteínas, aminoácidos e
outras substâncias.

Como resultado de processos repetidos de absorção e

adsorção durante o movimento dos componentes da amostra ao
longo da fase estacionária, a separação é devida à diferença de
propriedades físico-químicas (polaridades) entre as substâncias
envolvidas na mistura com o eluente.
Exemplo:
Figura 1 - Cromatografia planar

Fonte: www.micronal.com.br/artigostecnicos/cromatografiaplanar2.htm - 18/11/2004.

 Tipos de Cromatografia

1 – Cromatografia em Papel;
2 – Cromatografia em Camada Delgada;
3 – Cromatografia por Adsorção;
4 – Cromatografia por Troca Iônica;
5 – Cromatografia por Exclusão
6 – Cromatografia por Bioafinidade;
7 – Cromatografia Gasosa;
8 – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência;
 Tipos de Cromatografia

1- Cromatografia em Camada Delgada

A cromatografia em camada delgada (CCD) consiste
na separação dos componentes de uma mistura através da
migração diferencial sobre uma camada delgada de
adsorvente retido sobre uma superfície plana.
O processo de separação está fundamentado,
principalmente, no fenômeno da adsorção, permitindo
emprego tanto na separação de substâncias hidrofóbicas
(apolares) como hidrófilas (polares).
Entre os adsorventes mais utilizados em CCD estão a
sílica, alumina, celulose e poliamida.
1.1 Sílica (SiO2)
Apresenta caráter fracamente ácido, que pode ser
aumentado pela presença de impurezas ácidas, podendo
ocorrer como fenômenos de quimiosorção de bases ou
reações ácido-catalizadas das amostras.
Em geral, a sílica é empregada na separação de
compostos lipofílicos como aldeídos, cetonas, fenóis, ácidos
graxos, aminoácidos, alcalóides, terpenóides e esteróides,
usando o mecanismo de adsorção.
1.2 Alumina (Al2O3)
A alumina é, depois da sílica, o adsorvente mais
utilizado, é geralmente empregada na separação de
compostos lipofílicos, como hidrocarbonetos policíclicos,
alcalódes, aminas e vitaminas lipossolúveis.
1.3 Celulose (fase estacionária)
a) A celulose empregnada com polietilenoimina (PEI –
celulose) – separa nucleotídeos e nucleosídeos;
b) A carboximetil-celulose (CM – celulose) – separa
proteínas;
c) A celulose alcalina trietanolamina e epicloridrina
(ECTEOLA – celulose) – separa proteínas e ácidos nucléicos.
1.4 Poliamida
Separa fenóis e ácidos carboxílicos
1.5 Outros
Uréia e polietileno separa ácidos graxos.
Silicato de cálcio ou de magnésio separa fenóis
1.6 Preparação de placas
A camada de adsorvente sobre a placa de vidro, ela é seca
ao ar livre, ficando sua superfície ficar opaca, e conseqüentemente
o adsorvente fixado no vidro.
O tempo necessário para isto é variável.
PEI-celulose necessitam 12 horas para secarem as
poliamidas ficam prontas em 30 minutos.
1.7 Ativação das placas
Temperaturas mais elevadas, por tempo prolongado,
tornam a maioria dos adsorventes mais ativos.
Sílica, alumina são ativadas a 105-110°C por 30 a 60
minutos.
A celulose não deve ser aquecida por mais de 10 minutos a
105°C.
1.8 Revelação dos cromatogramas
Visualizações pode ser feita através de métodos
físicos ou químicos, podendo também ser biológicos como
no caso da utilização de reações enzimáticos ou bacterianos.
Muitos compostos podem ser visualizados através
de luz ultravioleta, por se tornarem fluorescentes quando
excitados por essas radiações (faixa 254 a 366 nm).
Quando as substâncias não são fluorescentes pode-
se utilizar adsorventes impregnados com reagentes
fluorescentes e neste caso observamos manchas escuras
contra o fundo claro.
2 - Cromatografia Adsorção.
2.1 A coluna
Constitui de um tubo de vidro, em posição vertical;
A extremidade superior é aberta e a inferior é afilada
terminando numa torneira, que permitirá o controle da vazão da
fase móvel.
2.2 Os processos de adsorção em coluna
Deve-se considerar a atividade do adsorvente (força de
adsorção).
As substâncias eluirão da coluna segundo a sua
polaridade.
A atividade cromatográfica do sólido (fase estacionária),
tendo grupos polares, aumenta sobre substâncias polares,
observando-se a ordem:

-CO2H > -OH > -NH2 > -SH > -CHO > =CO > -CO2R > -OCH3 > -CH=CH-
2.3 Preparação dos adsorventes
Para ativação dos adsorventes (alumina, sílica gel,
silicato de magnésio, carvão ativo) eles são aquecidos para
dessorção de água e de outros materiais adsorvidos.
A temperatura nesse processo varia entre 200°C a
400°C.
A cromatografia em coluna tem a desvantagem de
produzir cauda (efeito de difusão) e, além disso, não
apresenta separações totalmente reprodutíveis em virtude
do adsorvente de mesmo lote pode ter suas atividades
variadas.
2.4 Reações na coluna
Os sólidos usados nas colunas cromatográficas às
vezes tornam-se catalizadores de reações. Este problema é
maior com alumina do que com sílica.
A alumina alcalina pode causar a condensação de
aldeídos e cetonas; neste caso se usaria uma alumina
neutra.
A acetona não é usada como fase móvel quando
se utiliza alumina. O carvão ativo pode levar à
decomposição química, e a sílica pode causar a
isomerização de terpenos e esteróides.
2.5 Escolha de eluentes
A escolha dos eluentes é ordem crescente de polaridade,
com o ponto de ebulição baixo.

Substâncias
1 – Hexano 6 – Tolueno 11 – Piridina
2 – Éter de petróleo 7 – Diclorometano 12 – Acetona
3 – Ciclohexano 8 – Clorofórmio 13 – Etanol
4 – Tetracloreto de carbono 9 – Éter Etílico 14 – Metanol
5 – Benzeno 10 – Acetato de etila 15 – Ácido acético
2.6 Eluição
Para ocorrer uma completa separação a fase móvel deve:
 Ser fracamente adsorvida pela fase estacionária;
 Não ser afetada quimicamente;
 Possibilitar realmente o desenvolvimento de uma corrida
cromatográfica, ocasionado por um determinado grau de adsorção.

2.7 Uso da cromatografia por adsorção

 Em laboratórios de química orgânica para separar e purificar
reagentes e materiais obtidos por sínteses;
 Em laboratórios de produtos naturais, os quais são normalmente
submetidos a este método cromatográfico em escala preparativa e
analítica;
 Em laboratórios de análises clínicas para separar esteróides de urina
ou de sangue, etc.
3 – Cromatografia líquida ou LC.
É uma das técnicas de cromatografia mais utilizada, em
que a fase móvel é um liquido de baixa viscosidade.
3.1 - Técnicas
a) Se a fase estacionária for um adsorvente sólido através
do qual e por recurso a uma alta pressão se faz passar a fase
estacionária e a amostra, temos a cromatografia líquida de alta
precisão (HPLC).
b) Se a fase estacionária for um sólido iônico temos a
cromatografia de permuta iônica (IEC).
c) Se a fase estacionária for um sólido poroso fazendo-se
a separação em função do tamanho molecular (sem interações
entálpicas) temos a cromatografia de exclusão molecular (SEC).
3.2 – Características das Fases Móveis em CLAE.
a. Ser de alto grau de pureza ou de fácil purificação;
b. Dissolver a amostra sem decompor os seus componentes;
c. Não decompor ou dissolver a fase estacionária;
d. Ter baixa viscosidade;
e. Ser compatível com o tipo de detector utilizado;
f. Ter polaridade adequada para permitir uma separação
conveniente dos componentes da amostra;
3.3 – Características das Fases Estacionárias em
CLAE.

a. Sólidos rígidos, semi-rígidos ou não rígidos;

b. Partículas porosas ou peliculares;
c. Partículas esféricas ou irregulares;
d. Partículas com diferentes diâmetros;
3.3 – Detectores usados em CLAE.

a. Absorvância no ultravioleta,visível, e infravermelho;

b. Por fluorescência;
c. Índice de refração;
d. Eletroquímicos;
e. Radioatividade;
3.4 – Aplicações

Técnicas analíticas qualitativa e quantitativa, para as

indústrias químicas, farmacêuticas e outras.
Atua na identificação de substâncias, como por
exemplo, esteróides a base de cortisona, hormônios,
proteínas, e outras substâncias químicas, tais grupos
amônios, aldeídicos, cetônicos, carboxílicos, e outros.
 Considerações

As técnicas cromatográficas tem larga aplicação

nas áreas químicas e bioquímicas, nas pesquisas e
indústrias, que predestinam identificar as naturezas físicas-
quimicas de substancias em substratos, visando a sínteses
de novos quimicos, que possam ser produzidos para fins
comerciais.