PRODUÇÃO DE ENZIMAS

MICROBIANAS
Prof. Ms. Rodrigo Mendes
Produção industrial de enzimas

 A produção de enzimas em escala industrial se faz

majoritariamente por fermentação submersa, embora
nos países orientais haja uma tradição estabelecida de
fermentação semissólida.

Casca de arroz
Processos a montante (“upstream”) da
fermentação
 Poucos são os processos prévios á fermentação, no caso da produção de
enzimas, um dos mais importantes é o preparo do inóculo.
 Pode-se partir de um cultivo em frasco agitado, inóculo com a cultura
estoque liofilizada.
 Controles nas transferências – para observar os seguintes aspectos:
 presença de contaminação;
 infecção por bacteriófagos;
 proliferação de mutantes de menor eficiência.
 O número de transferências deve ser reduzido ao mínimo possível.
PROCESSO FERMENTATIVO

 A linhagem microbiana utilizada industrialmente é fruto de trabalho

de melhoramento e portanto sigilosamente protegida.

 A manutenção da linhagem requer um trabalho constante de

microbiologia.

 Cuidados importantes – estocagem e manutenção – para reprodução

de resultados experimentais em trabalhos de pesquisa.
PROCESSO FERMENTATIVO

 Do ponto de vista industrial, os meios sintéticos, são muito caros, a

opção é feita por meios que contenham matérias-primas da
agroindústria.

 Meios – devem conter fontes de carbono e energia, fontes de

nitrogênio, substância minerais e fatores de crescimento.

 Composição do meio de cultivo – usado industrialmente (sigilosos).

PROCESSO FERMENTATIVO

 A literatura indica os constituintes empregados.

 Fontes de carbono e energia: farinhas amiláceas, licores de

milho, soja, melaços.

 Fontes de nitrogênio: farinha de peixe, gelatinas, licores de milho

e soja.

 Fatores de crescimento e micronutrientes: extrato de levedura,

licor de milho, farinhas de sementes oleaginosas.
PROCESSO FERMENTATIVO

 Fermentação:

 Fermentadores, mecanicamente agitados.

 Meios concentrados – pode conduzir a elevada viscosidade. Com

isso a energia gasta para agitação e aeração pode incidir sobre o
custo final do produto.

 A utilização de tais meios, pode provocar formação de espuma

(utilizar antiespumantes).
PROCESSO FERMENTATIVO

 Fermentadores – apresentam:

 camisas ou serpentinas internas para aquecimento e

refrigeração;

 sistema de medidas – sensores de pH, temperatura, oxigênio

dissolvido, espuma.

 Duração – 30 a 150 horas (fermentação em batelada para

produção de enzimas).
Processo a jusante (“downstream”) da
fermentação

 Etapas envolvidas na recuperação e processamento pós

fermentação.

 Não é diretamente comercializado – caldo fermentado livre de

células, sem processamento adicional.

 Muito comercializado – a enzima de interesse é recuperada do

caldo fermentado, purificada até um certo grau.
Processo a jusante (“downstream”) da
fermentação

 Etapas de separação e purificação:

 Finalidade:

- remover substâncias tóxicas

 Para a obtenção de preparação enzimática de uso farmacêutico,

processos mais sofisticados de purificação são utilizadas.
ETAPAS INICIAIS DE SEPARAÇÃO E CONCENTRAÇÃO

 Enzimas:

o caldo é resfriado a ~ 5 ºC, com o objetivo de assegurar

condições de estabilidade do produto;

 evitar crescimento de mos contaminantes;

 pH ajustado para valor ótimo da atuação da enzima produzida.

ETAPAS INICIAIS DE SEPARAÇÃO E CONCENTRAÇÃO

 Separação das células: centrifugação; filtração.

 Fungos filamentosos – centrifugação;

 Bactérias e leveduras – prévia floculação (cloreto de cálcio);

eficiente; baixo custo.

 A filtração, como alternativa a centrifugação – utilização de

filtros-prensa, filtros rotativos á vácuo.
ETAPAS INICIAIS DE SEPARAÇÃO E CONCENTRAÇÃO

 Solução concentrada – filtração em meio filtrante de

celulose – preparado enzimático líquido – diluído e
acondicionado com estabilizantes da atividade enzimática
– embalado para comercialização.
ETAPAS FINAIS DE PRODUÇÃO:
PURIFICAÇÃO E ACABAMENTO

 À partir da obtenção de um concentrado enzimático:

 Concentrado líquido – produto bruto comercializável em

certos mercados.

 Diversas razões (aplicação, transporte, estocagem) pode

ser preferível a obtenção de um preparado enzimático
bruto na forma sólida.
ETAPAS FINAIS DE PRODUÇÃO:
PURIFICAÇÃO E ACABAMENTO

 O concentrado deve ser seco á vácuo ou por atomização (spray

drying). Produto final – não pode apresentar baixa granulometria,
pois há risco de geração de poeira.

 Aglomeração – para obter partículas maiores, faixa de 200 a 500 μm.

 Para obter maior grau de pureza – submeter o concentrado líquido a

técnicas de fracionamento e purificação.
ETAPAS FINAIS DE PRODUÇÃO:
PURIFICAÇÃO E ACABAMENTO

 Técnicas que utilizam membranas:

 ultrafiltração;

 microfiltração;

 osmose inversa.

 Desvantagem - não apresentam alta seletividade. Portanto

utilizado em combinação com outras técnicas ou nas etapas de
concentração de solutos.
ETAPAS FINAIS DE PRODUÇÃO:
PURIFICAÇÃO E ACABAMENTO

 Técnicas cromatográficas:

 Busca de maior grau de pureza do produto.

 Cromatografia de troca iônica – utiliza resinas a base de celulose, géis

de dextrana. Alta seletividade, porém tempos de processamento
elevados.
ETAPAS FINAIS DE PRODUÇÃO:
PURIFICAÇÃO E ACABAMENTO

 Cromatografia de filtração em gel – critério de separação – tipo e

tamanho da molécula. Utiliza – polímeros de ligação cruzada com
diâmetros de poros estabelecidos e apresenta alta seletividade.

 Cromatografia de afinidade – baseia-se na ligação bioespecífica da

enzima com os ligantes (substratos ou inibidores). Alta seletividade,
aplicada em laboratório (restrição).
ETAPAS FINAIS DE PRODUÇÃO:
PURIFICAÇÃO E ACABAMENTO

 Exemplos de proteínas purificadas por processos cromatográficos:

 insulina;

 malato desidrogenase;

 glicoquinase.
ETAPAS FINAIS DE PRODUÇÃO:
PURIFICAÇÃO E ACABAMENTO

 Grau de purificação desejado está associado á aplicação do produto.

 No mercado:

Disponíveis

 preparações pouco purificadas para uso técnico ou industrial;

 preparações de alto grau de pureza para uso analítico ou

farmacêutico.
Como selecionar os microrganismos que serão
utilizados nos processos biotecnológicos?

 Crescer in vitro;
 Crescer em larga escala;
 Crescer mesmo em condições subótimas;
 Não ser patogênico;
 Ser facilmente manipulável e geneticamente estável;
 Produzir a enzima de interesse em grandes
quantidades;
 Não demandar grandes custos de produção;