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Análise Instrumental

Técnicas de Separação
CAL 410012
Profa. Ana Carolina Costa
ana.costa@ufsc.br

Introdução às separações
HPLC
Conceitos
• A FASE ESTACIONÁRIA em cromatografia é imobilizada em uma coluna
ou sobre uma superfície plana.

• A FASE MÓVEL em cromatografia movimenta-se através da fase


estacionária transportando a mistura dos analitos. A fase móvel pode ser
um gás, um líquido ou um fluido supercrítico.

• A ELUIÇÃO é um processo no qual os solutos são levados através da fase


estacionária pelo movimento de uma fase móvel. A fase móvel que deixa
a coluna é denominada eluato.

• Um ELUENTE é um solvente empregado para transportar os


componentes de uma mistura através de uma fase estacionária.

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Conceitos

(a) Diagrama descrevendo a


separação de uma mistura dos
componentes A e B por eluição em
cromatografia em coluna.

(b) O sinal do detector em vários


estágios da eluição mostrados em
(a)

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Conceitos

Perfis de concentração dos solutos A e B na coluna no


t1 e mais tarde no t2  B é mais fortemente retido
pela fase estacionária do que A, portanto B se atrasa
durante a migração.
A distância aumenta a medida que os dois se movem
pela coluna.
Alargamento das bandas = perda de eficiência
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Conceitos
Muitas variáveis físicas e químicas influenciam as velocidades das bandas e
seu alargamento. Como consequência, melhores separações podem ser
geralmente obtidas pelo controle de variáveis que aumentam a velocidade
de separação das bandas ou diminuem a velocidade de alargamento delas.

Cromatograma original com picos


sobrepostos

Melhoria proporcionada pelo


aumento da separação das bandas

Melhoria proporcionada pela


diminuição das larguras

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Conceitos
A extensão do alargamento de uma banda depende do tempo
que a FM fica em contato com a FE, o qual por sua vez depende
da vazão da FM.

• VOLUME DE RETENÇÃO (VR) é o volume da fase móvel necessário para


eluir o analito a uma dada vazão (F).
Volume de retenção, VR = tR F

• VOLUME MORTO (VM) é o volume total de solvente na coluna entre as


partículas da fase estacionária (partículas não porosas) e no interior dos
poros das partículas (partículas porosas, tipo esponja). Portanto, se o
tempo para que a fase móvel ou o soluto não retido passe pela coluna é
tM, e a vazão é F:
VM = tM F

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Conceitos
 FATOR DE RETENÇÃO*: o fator de retenção (k) é o grau de retenção de
um componente da amostra na coluna, sendo definido como o tempo
necessário para eluir o pico (tR) menos o tempo necessário para a FM
passar através da coluna (tM).

tR – tM t‘R
k= =
tM tM

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Fator de capacidade em algumas referências.
*
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Conceitos – Fator de retenção
• Um pico com k = zero, indica um componente não retido
pela FE e eluído com o solvente. Portanto, quando k é  1,
separação ruim, tR  tM.
• Quando k é > 20 ou 30, a separação é lenta, indica que o
soluto está altamente retido, apresentando tempos de
eluição muito longos. Sendo de difícil detecção, uma vez que
apresentam alargamento das bandas.
• Na maioria das análises, os compostos eluem com k entre 1 e
20, então esses possuem “oportunidade suficiente” para
interagir com a FE, resultando em uma migração
diferenciada.
• Separação ideal: k entre 1 e 5.

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Conceitos – Constante de distribuição
• A eficiência de uma coluna cromatográfica em separar dois solutos
depende em parte das velocidades relativas segundo as quais as duas
espécies são eluídas. Essas velocidades, por sua vez, são determinadas
pelas razões das concentrações dos solutos em cada uma das fases.

• Todas as separações cromatográficas estão baseadas em diferenças de


extensão na qual os solutos são distribuídos entre as fases móvel e
estacionária. Para o soluto de espécie A, o equilíbrio envolvido é descrito
pela equação
A (móvel)  A (estacionária)
• A constante de equilíbrio K para essa reação é denominada constante de
distribuição, a qual é definida como:
[A]E
K=
[A]M
onde, [A]E e [A]M são a concentração do analito A na FE e FM,
respectivamente.
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Conceitos – Constante de distribuição
• Então, a distribuição do analito A é governada pela constante de
distribuição (também chamada de coeficiente de partição), K.

• O fator de retenção (k) também pode ser descrito pela razão do número
total de mols do analito em cada fase:

mols do soluto A na FE
k=
mols do soluto A na FM

k=
[A]E VE , sendo
K=
[A]E então, k = K VE
[A]M VM [A]M VM

• Onde VE é o volume da fase estacionária e VM é o volume da fase móvel na


coluna ou o volume morto. k é primariamente controlado pela força da
fase móvel, a natureza da fase estacionária, e a temperatura em que a
separação é realizada. OU SEJA,
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Fatores que influenciam
a retenção de um soluto
 A separação é efetuada tendo por base a afinidade química relativa de
cada componente da amostra pelas fases móvel e estacionária.
 Este parâmetro depende de:
 Tipo e propriedades da fase estacionária
 Tipo e propriedades da fase móvel
 Forças intermoleculares:
•Forças de dispersão de London
 Analito e fase móvel
(interações dipolo induzido – dipolo induzido)
 Analito e fase estacionária •Interações dipolo – dipolo induzido
•Interações iônicas
 Temperatura •Pontes de hidrogênio

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Conceitos – Fator
de separação (seletividade)
• O fator de seletividade  (ou fator de separação) para os solutos 1 e 2 é
definido como a razão entre a constante de distribuição do soluto mais
retido (2) e a constante de distribuição para o soluto menos retido (1).
• A seletividade deve
ser > 1,0 para que haja
a separação dos picos.
• Seletividade é
dependente de muitos
fatores que afetam K
tal como a natureza da
FE, composição da FM,
e propriedades dos
solutos.

K, constante de distribuição; k = fator de retenção Análise Instrumental – Técnicas de separação


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Exercícios:
1) Em uma análise cromatográfica de ácido de baixo peso molecular, o
ácido butírico elui com um tempo de retenção (tR) de 7,63 min. O tempo
de retenção da fase móvel (tM) é 0,31 min. Calcule o fator de retenção (k)
do ácido butírico. (23,6)

2) Na mesma análise cromatográfica para ácidos de baixo peso molecular


do exemplo anterior, o tempo de retenção para o ácido isobutírico é 5,98
min. Qual o fator de separação (α) para o ácido butírico e isobutírico?
(1,29)

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Conceitos – Resolução
• A resolução Rs de uma coluna nos diz o quanto duas bandas
se distanciam uma em relação a outra em comparação com
as suas larguras.
• A resolução fornece uma medida quantitativa da habilidade
da coluna em separar dois analitos.

Rs = 2 (tR )2–(t R ) 1 Rs = (tR )2 –(tR ) 1


w1 + w 2 (w1 + w2)/2

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Conceitos – Resolução

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Conceitos – Resolução

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Exercício
3) Um pico com tempo de retenção de 407 s tem uma largura na base de 13
s. Um pico vizinho é eluído a 424 s com uma largura de 16 s. Encontre a
resolução entre esses dois componentes. (1,17)

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Conceitos – Descrição
quantitativa da eficiência da coluna
TEORIA DOS PRATOS
MARTIN e SYNGE: em 1920 estabeleceram analogias entre a
cromatografia, a destilação e a extração com solventes;
• Consideraram que uma coluna cromatográfica consistia de
vários estágios de extração líquido-líquido, ou pratos
teóricos (termo emprestado da teoria da destilação,
técnica popular na época)  sendo conhecido como teoria
dos pratos.

PRÊMIO NOBEL em 1952

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Conceitos – Descrição
quantitativa da eficiência da coluna
TEORIA DOS PRATOS
Entretanto, uma coluna cromatográfica não
possui os pratos como na destilação, mas a
fase estacionária é distribuída uniformemente,
de maneira que vários estágios de equilíbrio
entre a FE e a FM irão ocorrer.
Pela inexistência de pratos reais como em
destilação, estes pratos foram denominados de
pratos teóricos.
Contudo, o modelo de pratos não é bem
sucedido ao tentar explicar o alargamento das
bandas, mas serve para explicar o formato
gaussiano dos picos cromatográficos, bem
como os fatores que influenciam as  nas
velocidades de migração dos solutos.
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Conceitos – Descrição
quantitativa da eficiência da coluna
Dois termos relacionados são empregados amplamente para
as medidas quantitativas da eficiência da coluna
cromatográfica
• Altura de prato H
• Contagem de pratos ou número de pratos teóricos N
As duas estão relacionadas pela equação: H ou HETP = L
N
em que L é o comprimento (geralmente em cm) do recheio da
coluna.
A eficiência cromatográfica aumenta à medida que o número
de pratos se torna maior, e, conforme a altura do prato H
torna-se menor.
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Conceitos – Altura H ou HETP=
L
N
equivalente a um prato
• A altura do prato, H, foi adaptado da teoria da destilação (já
discutido anteriormente) , onde a separação pode ser feita
em estágios discretos denominados pratos. A altura do prato
também é conhecida como altura equivalente a um prato
teórico (HETP ou H). Ela é, aproximadamente, o
comprimento da coluna necessário para que o soluto atinja
um equilíbrio entre as fases móvel e estacionária.
• Quanto menor a altura do prato, menor a largura da banda.
• A capacidade de uma coluna em separar os componentes de
uma mistura aumenta com a diminuição da altura do prato.
• Dizemos que uma coluna eficiente tem mais pratos teóricos
do que uma coluna ineficiente.

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Conceitos – Altura
equivalente a um prato
• Solutos diferentes, passando através da mesma coluna,
possuem alturas de pratos diferentes, pois possuem
coeficientes de difusão diferentes.
• Curiosidade: as
alturas dos pratos se
situam na faixa de 
0,1 a 1 mm na CG,  10
µm na HPLC e < 1 µm
na EC.
L
H=
N

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Conceitos – Altura
equivalente a um prato
• Uma vez que o modelo de pratos não constitui uma
representação muito boa de uma coluna cromatográfica,
alguns autores sugerem que se evite atribuir qualquer
significado aos termos prato e altura de prato e, veja esses
termos como designadores de eficiência da coluna que são
mantidos por razões históricas somente, e não porque
apresentem qualquer significado físico.
• Esses termos estão bem estabelecidos na literatura
cromatográfica que a sua substituição por designações mais
apropriadas parece improvável (pelo menos num futuro
próximo)

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Conceitos – Descrição
quantitativa da eficiência da coluna

O número de pratos teóricos, N, e a altura de prato, H,


são amplamente utilizados na literatura pelos
fabricantes de instrumentos como uma medida do
desempenho da coluna.
N pode ser determinado a partir de um cromatograma,
pelo conhecimento de tR e Wb ou W1/2

2 2
N = 16 tR N = 5,546 tR Para picos mal
wb W½ resolvidos

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Conceitos – Descrição
quantitativa da eficiência da coluna

tR = 1,67 min

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Conceitos – Número de pratos

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Eficiência da coluna
VARIÁVEIS CINÉTICAS QUE AFETAM A EFICIÊNCIA DA COLUNA
O alargamento da banda reflete-se em uma perda da eficiência da coluna. Quanto
mais lentas forem as velocidades dos processos de transferência de massa que
ocorrem durante a migração do soluto através da coluna, maior será o alargamento
da banda na saída da coluna. Algumas variáveis que afetam as velocidades de
transferência de massa podem ser controladas e exploradas para melhorar as
separações.
Algumas variáveis importantes:
Variável Símbolo Unidades usuais
Velocidade linear da FM u cm s-1
Coeficiente de difusão na fase móvel* DM** cm2 s-1
Coeficiente de difusão na fase estacionária* DS cm2 s-1
Fator de retenção (ver Eq.) k adimensional
Diâmetro das partículas do recheio dp cm
Espessura do filme líquido que recobre o df cm
suporte
*Aumenta com o aumento da temperatura e com a diminuição da viscosidade. **Em líquidos, os valores de DM, para moléculas de
tamanho pequeno e médio são da ordem de 10 -5 cm2 s-1; em gases, os valores de D são  105 vezes maiores
Eficiência cromatográfica
Equação de van Deemter (1950)
A Equação, denominada equação de van Deemter, foi desenvolvida por
engenheiros químicos da Holanda, em 1950, e é muito usada para descrever
a eficiência de uma coluna cromatográfica.

H = A + B/u + (CE + CM) u

Onde H é a altura de prato em centímetros e u é a velocidade linear da


fase móvel em centímetros por segundos. O termo A é um coeficiente que
descreve os efeitos dos caminhos múltiplos (difusão tubilhonar ou
turbulenta); B é o coeficiente de difusão longitudinal; e CE e CM são os
coeficientes de transferência de massa para as fases estacionária e
móvel, respectivamente.

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Eficiência cromatográfica

CAMINHOS DIFUSÃO
MÚLTIPLOS LONGITUDINAL
termo A termo B

H = A + B/u + (CE + CM) u

TRANSFERÊNCIA DE MASSA NA TRANSFERÊNCIA DE MASSA


FASE ESTACIONÁRIA NA FASE MÓVEL
termo Cs termo Cm
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EQUAÇÃO de van DEEMTER A = 2 l dP

o termo A (caminhos múltiplos)


o diâmetro da partícula
Detector
caminhos múltiplos de fluxo

Uma vez que diferentes moléculas do


mesmo soluto tomam diferentes
caminhos, elas chegarão ao final do
leito em diferentes tempos, e a zona Sinal detectado
como um todo vai se alargar. Por que
o leito cromatográfico apresenta
caminhos irregulares. Tempo
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l: constante que depende da qualidade do enchimento da coluna Profa. Ana Carolina Costa
B/u = (2 g DM) / u
EQUAÇÃO de van DEEMTER
o termo B/u (difusão longitudinal)
•a grandeza do termo B é predominantemente
determinada pelo coeficiente de difusão DM do
analito na fase móvel e é diretamente proporcional a
essa constante.
•as moléculas da amostra irão difundir de uma região de maior
concentração (banda inicial ou centro da zona) para uma região de
concentração menor.
•contribuição da difusão longitudinal é inversamente proporcional à
velocidade da fase móvel: com o aumento de u, soluto permanece na coluna
por períodos mais curtos (difusão tem menos tempo para ocorrer).
DM: coeficiente de
difusão do soluto
na FM

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: constante que depende da qualidade do enchimento da coluna Profa. Ana Carolina Costa
EQUAÇÃO de van DEEMTER
o termo C (coeficientes de transferência de massa na FM)
CM u = (f(k) dp2 / DM) u
•ao passar no interstício de partículas, as moléculas que
viajam perto das paredes da fase estacionária terão
velocidades menores daquelas que viajam no centro.
•a velocidade da fase móvel aumenta o valor de H, porém,
o diâmetro da partícula contribui ainda mais por estar ao
quadrado.

o termo C (coeficientes de transferência de massa na FE)


CE u = (f(k) df2 / DE) u
•após a difusão das moléculas dentro do poro, elas
penetram na FE ou se ligam a ela por algum
mecanismo. Se algumas penetram mais
profundamente dentro da FE, também demorarão
mais a sair e consequentemente se atrasarão em
relação a outras e como consequência o pico se
alargará.
l, : constantes que
EQUAÇÃO de van DEEMTER dependem da qualidade do
recheio
DS, DM: coeficientes de
0,0060 difusão do soluto na fase
estacionária e móvel,
H = A + B/u + (CE + CM) u
H, cm

respectivamente
dp, df: diâmetro da partícula
0,0040
e espessura do filme que
H recobre o suporte da fase
estacionária
CE u
0,0020
Contribuição dos vários
termos de transferência de
CM u
massa para a altura do prato.
0
B/u
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
u, cm/s (velocidade da fase móvel)
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High Performance Liquid Chromatography

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

Cromatografia a líquido

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HPLC

“HPLC usa pressões elevadas para forçar a passagem


do solvente através de colunas fechadas que contém
partículas muito finas capazes de proporcionar
separações muito eficientes (com alta resolução)”.
Daniel C. Harris.

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Cromatografia líquida de alta eficiência

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reservatório da fase móvel e sistemas
Instrumentação de tratamento de solvente

• Recipientes contendo fase móvel que será bombeada dentro do sistema


analítico.

Características desejadas para reservatórios de FM são:

• Reservatórios com capacidade de 1 a 2 L, vidro (borossilicato) ou


dependendo da FM – outro polímero conveniente ou teflon;

• Sua tampa deve conter furos para a passagem de tubulações,


as quais servirão de canal de passagem de fase móvel
(linha de solvente). A superfície livre dos furos deve ser a menor possível a fim de
evitar a difusão de solvente para a atmosfera;

• É comum proceder-se a desgaseificação da FM, com a intenção de eliminar gases


nela dissolvidos que poderão, principalmente na bomba, criar bolhas, causando
aumento do ruído da linha de base;

• A linha de solvente deve possuir obrigatoriamente um filtro para reter partículas


sólidas porventura existente – vidro sinterizado.

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reservatório da fase móvel e sistemas de
Instrumentação tratamento de solvente
•Equipados com dispositivo para remoção de gases dissolvidos (evitar
formação de bolhas: causam alargamento ou interferem na eficiência do
detector)
•Desgaseificadores: bomba de vácuo
dispositivos para aquecimento e agitação do
solvente
borbulhamento de gases inertes (He ou N2) junto com
agitação
•Câmara de mistura: eluições em gradiente
•Solventes misturados à soluções tampão  altas concentrações de ácidos
orgânicos e sais devem ser evitadas  corrosão da bomba e outras partes do
equipamento; precipitação de sais, etc.

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Instrumentação sistemas de bombeamento

REQUISITOS:
•pressões de até 10 000 psi ( 690 bars)
•a maioria das partes de uma bomba de LC que entram em contato com a FM são
construídas de aço inoxidável
•vazão contínua, sem pulsos (ou, se pulsando, com amortecedor de pulsos)
•vazões de 0,01 a 10 mL/min (aplicações analíticas) e até 100 mL/min (aplicações
preparativas)
•devem ser capazes de pressurizar os solventes com precisão e exatidão (melhor que
0,5 %)
•devem ser compatíveis com ampla faixa de fluxo do solvente, fáceis de trocar de
solvente, e atender aos gradientes de eluição

2 TIPOS:
•bombas de pressão (ou pneumáticas)  recheio de colunas (gera elevadas pressões)
•bombas mecânicas: recíprocas  mais utilizadas (equipamentos comerciais)
deslocamento (tipo seringa)  reservatório da FM
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Instrumentação bombas recíprocas

coluna •2 válvulas (esferas de safira) são


abertas e fechadas alternadamente
para controlar a vazão de solvente
amortecedor dentro e fora do cilindro; solvente está
motor vedação
de pulso
em contato direto com o pistão
válvulas de
controle do
pistão recíproco tipo bola VANTAGENS:
• pequeno volume interno (35 a 400 mL)
solvente
• pressões elevadas de saída (até 10000
psi)
• fácil adaptação a eluição em gradiente
DESVANTAGENS:
• vazão constante
•fluxo pulsado que deve ser
amortecido (ruído de fundo na linha • fluxo independe da pressão de retorno
de base) da coluna e da viscosidade do solvente

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Instrumentação tipos de eluição

• Isocrática: A composição da fase móvel (%)


permanece constante durante toda a análise
cromatográfica. É realizada com um único
solvente ou mistura constante de solventes.
• Gradiente: Ocorre alterações da composição
da fase móvel (%) durante a execução da
análise.

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Instrumentação sistema de injeção de amostras

Válvula de injeção para HPLC com alça de


amostragem substituível em vários
tamanhos de volume fixo

•fator limitante da precisão: repetibilidade da injeção


•volumes devem ser pequenos (evitar alargamento de banda e sobrecarga da coluna,
“overload”): < 500 µL
•Conveniente  injetar amostra sem despressurizar o sistema

• sistema mais comum: alça de injeção (loop) mediante seringa; escolha de 0,5 a 500
µL; permite injeção a pressões de até 7000 psi; precisão melhor que 1%

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Instrumentação sistema de injeção das amostras

Bomba

Coluna

Loop

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Instrumentação colunas

•em geral, tubos de aço inoxidável, mas tubos de vidro com paredes
resistentes também são encontrados (restritos a pressões mais baixas, 600
psi)
•diversidade de colunas recheadas são disponíveis comercialmente, com
preços a partir de US$ 500 (colunas quirais > US$ 1000)

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Instrumentação colunas

Descrição Polaridade/ interação


Octadecil (C18) Altamente apolar

Octil (C8) Moderadamente apolar

Etil (C2) Fracamente apolar

Metil (C1) Fracamente apolar

Fenil (PH) Moderadamente apolar


Cicloexano (CH) Moderadamente apolar
Cianopropil (CN) Moderadamente apolar/polar
Diol ( 2 OH) Polar
Sílica (Si) Polar
Ácido Carboxílico (CBA) Troca catiônica fraca
Ácido Propilsulfônico (PRS) Troca catiônica forte
Ácido Benzenossulfônico (SCX) Troca catiônica forte
Aminopropil (NH2) Troca aniônica fraca/polar

Amina Primária/Secundária (PSA) Troca aniônica fraca/polar


Dietilaminopropil (DEA) Troca aniônica fraca/polar
Amina Quaternária (SAX) Troca aniônica forte
Ácido Fenilborônico (PBA) Covalente Análise Instrumental – Técnicas de separação
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Instrumentação colunas

•Colunas analíticas: em geral de 10 a 30 cm; 4 a 10 mm diâmetro com


partículas de 1,8, 3, 5 e 10 mm (60 000 pratos/m)
•Colunas de guarda ( de pré-coluna): introduzida antes da coluna de
separação para aumentar a vida útil desta
remove material particulado e contaminantes provenientes do solvente
(que se ligam irreversivelmente a FE)

serve para saturar a fase móvel com fase


estacionária minimizando a sangria da coluna

composição deve ser similar a da coluna analítica, com tamanho de


partícula em geral maior (minimizar queda de pressão)
•Termostatização: em geral coluna é operada a temperatura ambiente; no
entanto, cromatogramas de melhor qualidade são obtidos quando a
temperatura da coluna é controlada; fornos aquecidos até 150 C estão
disponíveis

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Profa. Ana Carolina Costa
Instrumentação características de um detector

Monitoramento do eluente que sai da coluna

ESTRATÉGIAS:
•medidas diferenciadas de propriedades gerais de ambas,
amostras e fase móvel
•medidas de uma propriedade da amostra que não é
apresentada pela fase móvel

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Instrumentação características de um detector

 Detectabilidade adequada: nem sempre é desejável, deve ser


compatível com a concentração do analito na amostra
 Resposta linear para os solutos que se estenda por
várias ordens de grandeza: faixa linear é aquela região da
curva de calibração que se ajusta bem a uma reta
 Baixo volume interno: grande volume pode gerar alargamento
das bandas geradas
 Tempo de resposta curto: detectores com respostas lentas
geram bandas deformadas (baixa e larga) e com cauda longa.
 Boa estabilidade e reprodutibilidade: aumenta a
confiabilidade nos resultados.
 Não deve ser destrutivo: permite coletar frações e utilizar
detectores em linha.
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Instrumentação tipos de detectores

2 TIPOS BASICAMENTE: SELETIVO versus UNIVERSAL


Os detectores em cromatografia líquida são de 2 tipos:
DETECTORES DE PROPRIEDADES UNIVERSAIS: respondem
às propriedades da fase móvel como um todo, como índice de
refração, constante dielétrica ou densidade, a qual é modulada
pela presença do soluto.
DETECTORES DE PROPRIEDADE DO SOLUTO ou SELETIVOS:
respondem a algumas propriedades do soluto (absorvância no
UV-vis, fluorescência ou corrente de difusão, que não incluem a
fase móvel.

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Instrumentação parâmetros de desempenho

•sensibilidade: relação entre o sinal produzido e a quantidade de amostra


que gera este sinal (termo relativo, depende da amostra)
•linearidade: faixa linear do sistema onde o sinal do detector é diretamente
proporcional à concentração do soluto; se concentração da amostra é muito
alta (diluições apropriadas)
•limite mínimo de detecção: menor quantidade da substância que pode ser
detectada, produzindo um sinal igual ao triplo do nível de ruído do
instrumento; ruído é a variação do sinal do instrumento que não é atribuída
à amostra e pode ser produzida por falhas eletrônicas, aparelhos mal
aterrados, variações de vazão ou temperatura, flutuações na tensão, bolhas
de ar no detector, componentes da matriz, etc.
•variações na composição da fase móvel podem produzir grandes flutuações
na linha de base, principalmente nos casos de eluição por gradiente

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Instrumentação detectores de absorvância

PRINCÍPIO: absorvância da luz por parte da amostra ao passar através


desta qualquer radiação eletromagnética (normalmente do ultravileta até o
infravermelho)
•resposta seletiva: só detecta os componentes da amostra que absorvem a
radiação no comprimento de onda selecionado; grande maioria das
substâncias absorvem radiação UV (substâncias com elétrons  ou elétrons
desemparelhados), por exemplo:
Olefinas ( hidrocarboneto alifático, ou seja, de cadeia aberta, apresentando
pelo menos uma ligação dupla entre os carbonos – alcenos), compostos
aromáticos e compostos contendo >C=O, >C=S, -N=O e –N=N-

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Instrumentação detectores de absorvância

da coluna

•volume é mantido pequeno para


janelas de
minimizar alargamento de banda: 1-
quartzo
10 mL
•comprimento: 2-10 mm
UV detector
•P < 600 psi (redutor de pressão é
requerido

descarte

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Instrumentação detectores de absorvância

Detectores mais utilizados em HPLC

Detector Limite de Gradiente Aplicação


detecção (ng)
Ultravioleta 0,1-1 Sim Seletivo
Índice de refração 100-1000 Não Universal
Espalhamento de luz 0,1-1 Sim Alta massa
molar
Eletroquímico 0,01-1 Não Seletivo
Fluorescência 0,0001-0,01 Sim Seletivo
Espectrometria de massas 0,1-1 Sim Universal
Infravermelho com 1000 Sim Seletivo
transformada de Fourier

Fonte: VOGEL, 2002; HARRIS, 2005.

Análise Instrumental – Técnicas de separação


Profa. Ana Carolina Costa
Fase móvel características desejáveis

alto grau de pureza ou de fácil purificação (permitir alta


sensibilidade nos detectores de absorvância ou fluorescência)
dissolver a amostra sem decompor os seus componentes
(se possível, solvente da amostra é a própria fase móvel)
não decompor ou dissolver a fase estacionária (uso da pré-
coluna para saturação da fase móvel com fase estacionária; fase
ligada ou sólida dispensam esse procedimento)
ter baixa viscosidade (favorecer transferência de massa)
ser compatível com o tipo de detector utilizado
(particularmente importante na eluição por gradiente)
ter polaridade adequada para permitir separação
conveniente dos componentes da amostra
Análise Instrumental – Técnicas de separação
Profa. Ana Carolina Costa
Fase móvel características desejáveis

SOLVENTE ÍNDICE DE VISCOSIDADE PONTO DE ÍNDICE DE FORÇA DO


REFRAÇÃO cP EBULIÇÃO C POLARIDADE ELUENTE*
n-Hexano 1,.372 0,30 81 0,04 -0,2
CCL4 1,457
Éter dietílico 1,350
THF 1,405 0,46 66 4,0 0,57
Clorofórmio 1,433
Etanol 1,359
Acetato de etila 1,370
MeOH 1,326 0,54 65 5,1 0,95
ACN 1,341 0,34 82 5,8 0,65
Etileno glicol 1,431
Água 1,333 0,89 100 10,2 grande

*sobre Al2O3
Cromatografia por partição
Tipo mais utilizado de cromatografia, na qual a FE é um
segundo líquido que é imiscível com o líquido da FM.

• Líquido-líquido: o líquido estacionário é mantido por adsorção


física.

• Fase ligada: o líquido estacionário encontra-se


quimicamente ligado, resultando em recheios altamente
estáveis, insolúveis na FM – compatíveis com as técnicas
de eluição por gradiente.

• Mais de 90% das análises atuais são realizadas com fase


ligada.
Análise Instrumental – Técnicas de separação
Profa. Ana Carolina Costa
Cromatografia de partição Fase ligada

A superfície da sílica completamente hidrolisada (por aquecimento com HCl 0,1 mol
L-1 por um ou dois dias) é constituída de grupos silanóis quimicamente reativos.

Si-OH + R3SiCl Si-O-Si-(CH3)2R + HCl

Os recobrimentos com fase ligada mais empregados são os siloxanos formados pela
reação da superfície hidrolisada da sílica com um organoclorossilano.

•• Ciano (-C2H4CN)
OH

Si R= Diol (-C3H6OCH2CHOHCH2OH)

silanol livre
Amina (–C3H6NH2)

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Cromatografia de partição fase normal x fase reversa

• Fase normal:
– fase estacionária polar;
– fase móvel menos polar que a FE (n-alcanos,
clorofórmio, acetato de etila);
– solutos neutros;
– polaridade soluto  t. retenção;
– mecanismo retenção: adsorção.

Análise Instrumental – Técnicas de separação


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Cromatografia de partição Fase normal

Polaridade do soluto: a > b > c


Polaridade da fase móvel

•Nos trabalhos pioneiros usou-


se fases altamente polares,
como trietilenoglicol adsorvidos
sobre sílica ou alumina e
solventes apolares, como
c b a hexano ou éter isopropílico,
tempo eram usados como fase móvel;
por razões históricas, este tipo
de cromatografia é chamado de
fase normal
c b a
tempo
•Em fase normal, o componente menos polar elui primeiro, devido a sua
maior solubilidade na fase móvel; aumentando a polaridade da fase móvel
tem o efeito de diminuir o tempo de eluição.
Análise Instrumental – Técnicas de separação
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Cromatografia de partição Fase normal

Partícula de sílica – partículas uniformes, porosas, mecanicamente rígidas, tendo


comumente diâmetros de 3 a 5 µm.

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Cromatografia de partição fase normal x fase reversa

• Fase reversa:
– fase estacionária apolar (geralmente um HC);
– fase móvel é um solvente relativamente polar (tampões,
água, metanol, acetonitrila, THF);
– solutos apolares, não-iônicos;
– polaridade f. móvel  t. retenção;
– mecanismo retenção: interações apolares com radicais
da coluna.

Análise Instrumental – Técnicas de separação


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Cromatografia de partição fase reversa

Polaridade do soluto: a > b > c


Polaridade da fase móvel

•Na cromatografia de fase


reversa, a fase estacionária é
a b c apolar, um hidrocarboneto por
tempo exemplo (C18) e a fase móvel é
relativamente polar (água,
metanol, acetonitrila, etc)

a b c
tempo
•Em fase reversa, o componente mais polar elui primeiro, devido a sua
maior solubilidade na fase móvel; aumentando-se a polaridade da fase móvel
aumenta-se o tempo de eluição

Análise Instrumental – Técnicas de separação


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Cromatografia de partição fase reversa

• Fase ligada

Análise Instrumental – Técnicas de separação


Profa. Ana Carolina Costa
Cromatografia de partição fase reversa

• Fase ligada

Análise Instrumental – Técnicas de separação


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Cromatografia de partição fase reversa

Si-OH + R3SiCl Si-O-Si-R3 + HCl

partição
(solubilização)

-SiR 2 iR 2
O
Si- Si-O-S
Si-O-SiR2
Si-O-SiR2
cadeias do soluto
hidrocarboneto
(C18)
Obs. nas fases ligadas, tem-se também a possibilidade de adsorção do soluto
devido aos sítios ativos (silanóis residuais)
Análise Instrumental – Técnicas de separação
Profa. Ana Carolina Costa
Cromatografia de partição fase reversa

A sílica tem aproximadamente 8 M de grupos


Si-OH por m2. A cobertura superficial por
silanização esta limitada a 4 M devido a efeitos
estéricos. Os Si-OH restantes são prejudiciais
causando alargamento das bandas devido a
polarização da superfície. Principalmente na
análise de analitos básicos. Reação com
trimetilsilano (efeito estérico reduzido -CH3)
minimiza o problema (encapados)

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Profa. Ana Carolina Costa
Fase móvel tipos de eluição

• Isocrática: A composição da fase móvel (%)


permanece constante durante toda a análise
cromatográfica. É realizada com um único
solvente ou mistura constante de solventes.
• Gradiente: Ocorre alterações da composição
da fase móvel (%) durante a execução da
análise.

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Profa. Ana Carolina Costa
Fase móvel tipos de eluição

A eluição isocrática é feita com um único solvente (ou mistura


de solventes). Se um solvente não propiciar uma eluição
suficientemente rápida de todos os componentes, então pode
ser utilizada uma eluição por gradiente.

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Profa. Ana Carolina Costa
Fase móvel tipos de eluição

• Separação isocrática por HPLC de uma mistura de compostos


aromáticos a 1 mL/min em uma coluna C18. Solvente A: água;
solvente B: acetonitrila (pH 3,5 aj. com KH2PO4)

1) Álcool benzílico
2) Fenol 4) benzoína
3) 3’-4’-dimetoxia
cetofenona

5) Benzoato de etila

6) Tolueno
7) 2,6-dimetoxi 8) ortometoxi
tolueno bifenila
Análise Instrumental – Técnicas de separação
Profa. Ana Carolina Costa
Fase móvel ISOCRÁTICO

força
Compostos
eluídos +
rápidos

Em uma separação em fase reversa, a força do eluente diminui quando o solvente


se torna mais polar.
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Fase móvel ISOCRÁTICO

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Fase móvel ISOCRÁTICO

duas horas de
corrida
cromatográfica

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Fase móvel tipos de eluição

Com base nas eluições isocráticas foi elaborado o


gradiente a seguir.

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Fase móvel GRADIENTE

Análise Instrumental – Técnicas de separação


Profa. Ana Carolina Costa
Fase móvel tipos de eluição

Pode haver várias formas de se separar um dado conjunto de


analitos, entretanto algumas informações são essenciais para
determinação do modo de operação

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Profa. Ana Carolina Costa
POLARIDADE DO SOLUTO
ESCOPO DA
CROMATOGRAFIA A insolúvel em água solúvel em água
LÍQUIDO não-polar iônico
•espécies MM>104: polar não-iônico
cromatografia por exclusão
102 ADSORÇÃO PARTIÇÃO TROCA
•espécies iônicas de baixa
IÔNICA
MM: cromatografia por troca fase fase
reversa normal
iônica 103 massa molecular
•espécies pequenas e polares,
mas não-iônicas: métodos de 104
permeação
partição (série homóloga) em gel
•espécies não-polares: EXCLUSÃO
105
cromatografia por adsorção
(isômeros estruturais, filtração
em gel
hidrocarbonetos alifáticos) 106

Figura 28-1 Skoog p642 vp


Conceitos
 TEMPO DE RETENÇÃO (tR): é o tempo decorrido entre a injeção da amostra e o
aparecimento do pico do soluto no detector de uma coluna cromatográfica.
tR = tE + tM
 TEMPO MORTO ou tempo de retenção da FM (tM ou t0): é o tempo necessário
para que um soluto não retido passe através de uma coluna cromatográfica.
 TEMPO DE RETENÇÃO
AJUSTADO (t’R): é igual
a (tR – tM), ou seja, o
tempo que o soluto
permanece na fase
estacionária. Então
tR = t’R + tM ou o tempo
de retenção, é o tempo
total que o soluto
permanece na FE (t’R) e
na FM (tM), então:
t’R = tE
Relembrando alguns conceitos
Cromatograma

t0 ou tM t’R

W1/2

Wb

Inject

Onde: tR = tempo de retenção


t’R = tempo de retenção ajustado
t0 = volume morto
Wb = largura da base do pico em unidade de tempo
W1/2 = largura a meia altura em unidade de tempo
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Relembrando alguns conceitos
Constante de distribuição: constante de equilíbrio para a distribuição do soluto A
entre as duas fases (móvel e estacionária)

A (móvel)  A (estacionária)
A constante de distribuição pode ser manipulada dentro de limites pela escolha
apropriada da fase móvel, da fase estacionária ou de ambas. Podemos alterar a razão
molar das duas fases pelo ajuste do volume da fase.

[A]E nE/VE
K= K=
[A]M nM/VM
Fator de retenção: parâmetro experimental importante amplamente usado para
comparar as velocidades de migração dos solutos nas colunas. A razão pela qual k é
tão útil é que ele não depende da geometria da coluna ou da vazão. Isso significa que
para uma dada combinação de soluto, FM e FE em qualquer coluna, com qualquer
geometria e operando em qualquer vazão de FM se dará o mesmo fator de retenção,
definido como: t‘ t t
= K VE
k ou k= R
= R– M
VM tM tM
Separação ideal: k entre 1 e 5.
Análise Instrumental – Técnicas de separação
Profa. Ana Carolina Costa
Relembrando alguns conceitos
Fator de separação: é uma medida da retenção relativa k2/k1 de dois componentes
da amostra. Onde k2 e k1 são os fatores de retenção para os solutos 2 e 1,
respectivamente.
k2
 = k1

tR – tM k2
A substituição da Eq. k = para os dois solutos na Eq.  =
tM k1

resulta em uma expressão que permite a determinação de  a partir de um


cromatograma obtido experimentalmente. (tR)2 – tM
=
(tR)1 – tM
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Profa. Ana Carolina Costa
Relembrando alguns conceitos
Descrição quantitativa da eficiência da coluna: a eficiência da coluna
cromatográfica aumenta à medida que o número de pratos N torna-se maior e à
medida que a altura de prato H torna-se menor.
Onde:
L L = comprimento da coluna
H=
N <H >N
H = altura do prato

A origem dos termos “altura de pratos” e “número


de pratos” encontra-se em um estudo teórico
pioneiro, feito por Martin e Synge, no qual eles
trataram uma coluna cromatográfica como se
fosse similar a uma coluna de destilação que,
em vez de ser constituída por numerosos pratos
discretos, apresentava camadas estreitas e
contínuas denominadas pratos. Considera-se que
em cada prato ocorre o equilíbrio do soluto entre
FM e FE. O movimento do soluto através da
coluna é, então, tratado como transferência em
etapas da FM em equilíbrio de um prato para o próximo.
Análise Instrumental – Técnicas de separação
Profa. Ana Carolina Costa
Relembrando alguns conceitos
Determinação experimental de H e N: o número de pratos pode ser
calculado a partir de duas medidas de tempo, tR e wb; para obter H, o
comprimento do recheio da coluna L também deve ser conhecido.
Como as determinações experimentais de H e N descritos são baseadas em
picos cromatográficos Gaussianos, os cálculos são considerados
estimativas. 2
2
t tR
N = 16 R N = 5,546
wb w½

Análise Instrumental – Técnicas de separação


Profa. Ana Carolina Costa
Cromatografia planar e de coluna
B/u = (2 g DM) / u
EQUAÇÃO de van DEEMTER

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