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Técnicas de Separação
CAL 410012
Profa. Ana Carolina Costa
ana.costa@ufsc.br
Introdução às separações
HPLC
Conceitos
• A FASE ESTACIONÁRIA em cromatografia é imobilizada em uma coluna
ou sobre uma superfície plana.
tR – tM t‘R
k= =
tM tM
• O fator de retenção (k) também pode ser descrito pela razão do número
total de mols do analito em cada fase:
mols do soluto A na FE
k=
mols do soluto A na FM
k=
[A]E VE , sendo
K=
[A]E então, k = K VE
[A]M VM [A]M VM
2 2
N = 16 tR N = 5,546 tR Para picos mal
wb W½ resolvidos
tR = 1,67 min
CAMINHOS DIFUSÃO
MÚLTIPLOS LONGITUDINAL
termo A termo B
respectivamente
dp, df: diâmetro da partícula
0,0040
e espessura do filme que
H recobre o suporte da fase
estacionária
CE u
0,0020
Contribuição dos vários
termos de transferência de
CM u
massa para a altura do prato.
0
B/u
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
u, cm/s (velocidade da fase móvel)
Análise Instrumental – Técnicas de separação
Profa. Ana Carolina Costa
High Performance Liquid Chromatography
Cromatografia a líquido
REQUISITOS:
•pressões de até 10 000 psi ( 690 bars)
•a maioria das partes de uma bomba de LC que entram em contato com a FM são
construídas de aço inoxidável
•vazão contínua, sem pulsos (ou, se pulsando, com amortecedor de pulsos)
•vazões de 0,01 a 10 mL/min (aplicações analíticas) e até 100 mL/min (aplicações
preparativas)
•devem ser capazes de pressurizar os solventes com precisão e exatidão (melhor que
0,5 %)
•devem ser compatíveis com ampla faixa de fluxo do solvente, fáceis de trocar de
solvente, e atender aos gradientes de eluição
2 TIPOS:
•bombas de pressão (ou pneumáticas) recheio de colunas (gera elevadas pressões)
•bombas mecânicas: recíprocas mais utilizadas (equipamentos comerciais)
deslocamento (tipo seringa) reservatório da FM
Análise Instrumental – Técnicas de separação
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Instrumentação bombas recíprocas
• sistema mais comum: alça de injeção (loop) mediante seringa; escolha de 0,5 a 500
µL; permite injeção a pressões de até 7000 psi; precisão melhor que 1%
Bomba
Coluna
Loop
•em geral, tubos de aço inoxidável, mas tubos de vidro com paredes
resistentes também são encontrados (restritos a pressões mais baixas, 600
psi)
•diversidade de colunas recheadas são disponíveis comercialmente, com
preços a partir de US$ 500 (colunas quirais > US$ 1000)
ESTRATÉGIAS:
•medidas diferenciadas de propriedades gerais de ambas,
amostras e fase móvel
•medidas de uma propriedade da amostra que não é
apresentada pela fase móvel
da coluna
descarte
*sobre Al2O3
Cromatografia por partição
Tipo mais utilizado de cromatografia, na qual a FE é um
segundo líquido que é imiscível com o líquido da FM.
A superfície da sílica completamente hidrolisada (por aquecimento com HCl 0,1 mol
L-1 por um ou dois dias) é constituída de grupos silanóis quimicamente reativos.
Os recobrimentos com fase ligada mais empregados são os siloxanos formados pela
reação da superfície hidrolisada da sílica com um organoclorossilano.
•• Ciano (-C2H4CN)
OH
Si R= Diol (-C3H6OCH2CHOHCH2OH)
silanol livre
Amina (–C3H6NH2)
• Fase normal:
– fase estacionária polar;
– fase móvel menos polar que a FE (n-alcanos,
clorofórmio, acetato de etila);
– solutos neutros;
– polaridade soluto t. retenção;
– mecanismo retenção: adsorção.
• Fase reversa:
– fase estacionária apolar (geralmente um HC);
– fase móvel é um solvente relativamente polar (tampões,
água, metanol, acetonitrila, THF);
– solutos apolares, não-iônicos;
– polaridade f. móvel t. retenção;
– mecanismo retenção: interações apolares com radicais
da coluna.
a b c
tempo
•Em fase reversa, o componente mais polar elui primeiro, devido a sua
maior solubilidade na fase móvel; aumentando-se a polaridade da fase móvel
aumenta-se o tempo de eluição
• Fase ligada
• Fase ligada
partição
(solubilização)
-SiR 2 iR 2
O
Si- Si-O-S
Si-O-SiR2
Si-O-SiR2
cadeias do soluto
hidrocarboneto
(C18)
Obs. nas fases ligadas, tem-se também a possibilidade de adsorção do soluto
devido aos sítios ativos (silanóis residuais)
Análise Instrumental – Técnicas de separação
Profa. Ana Carolina Costa
Cromatografia de partição fase reversa
1) Álcool benzílico
2) Fenol 4) benzoína
3) 3’-4’-dimetoxia
cetofenona
5) Benzoato de etila
6) Tolueno
7) 2,6-dimetoxi 8) ortometoxi
tolueno bifenila
Análise Instrumental – Técnicas de separação
Profa. Ana Carolina Costa
Fase móvel ISOCRÁTICO
força
Compostos
eluídos +
rápidos
duas horas de
corrida
cromatográfica
t0 ou tM t’R
W1/2
Wb
Inject
A (móvel) A (estacionária)
A constante de distribuição pode ser manipulada dentro de limites pela escolha
apropriada da fase móvel, da fase estacionária ou de ambas. Podemos alterar a razão
molar das duas fases pelo ajuste do volume da fase.
[A]E nE/VE
K= K=
[A]M nM/VM
Fator de retenção: parâmetro experimental importante amplamente usado para
comparar as velocidades de migração dos solutos nas colunas. A razão pela qual k é
tão útil é que ele não depende da geometria da coluna ou da vazão. Isso significa que
para uma dada combinação de soluto, FM e FE em qualquer coluna, com qualquer
geometria e operando em qualquer vazão de FM se dará o mesmo fator de retenção,
definido como: t‘ t t
= K VE
k ou k= R
= R– M
VM tM tM
Separação ideal: k entre 1 e 5.
Análise Instrumental – Técnicas de separação
Profa. Ana Carolina Costa
Relembrando alguns conceitos
Fator de separação: é uma medida da retenção relativa k2/k1 de dois componentes
da amostra. Onde k2 e k1 são os fatores de retenção para os solutos 2 e 1,
respectivamente.
k2
= k1
tR – tM k2
A substituição da Eq. k = para os dois solutos na Eq. =
tM k1