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 INTRODUCCION

‡ Los nuevos métodos para la detección de residuos de

organismos genéticamente modificados (OGM )
‡ El incremento de productos derivados de OGM que
han sido lanzados al mercado
‡ El aumento de demandas por parte de los
consumidores para que se establezcan regulaciones
mas estrictas en el etiquetado de estos productos
‡ Regulaciones para productos que contengan mas de
0.9% de soya (Roundup Ready) y maíz Bt-176
‡ En ingredientes específicos para aditivos y
saborizantes derivados de cultivos GM
 REACCIÓN EN CADENA DE LA
POLIMERASA
‡ Conocida como PCR es una técnica de biología
molecular desarrollada en 1986 por Kary Mullis
‡ Es obtener un gran número de copias de un
fragmento de ADN particular partiendo de un
mínimo
‡ En teoría basta partir de una única copia de ese
fragmento original o molde
‡ Reactivos: Para realizar la técnica se necesitan
± Los 4 desoxirribonucleósidos-trifosfato (dNTP), para
polimerizar nuevo ADN
± Dos cebadores o iniciadores oligonucleótidos que son,
cada uno, complementarios a una de las dos hebras
del ADN
± Iones divalentes. Se suele usar (Mg2+), También se
puede emplear (Mn2+)
± Iones monovalentes, como el potasio
± Una solución tampón
± ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas
70 °C
± ADN molde
± Termociclador, el aparato que va a mantener la
temperatura necesaria
‡ Ciclo de amplificación: La técnica se basa en la
replicación del ADN
1.- Desnaturalización
2.- Hibridación
3.- Elongación

‡ Figura 1: Pasos básicos de la PCR (de Andy Vierstracte 1999)

 PCR multiplex
‡ PCR en la cual se amplifica más de una secuencia en
una misma reacción.
‡ Emplea dos o más pares de cebadores en único tubo
con el fin de amplificar simultáneamente múltiples
segmentos de ADN
‡ Consiste en combinar una única reacción todos pares
de cebadores
± Sus ventajas
‡ Obtiene la información de varios en una sola reacción
‡ Menor cantidad de molde para el análisis
‡ Menor cantidad de reactivos
‡ Rápida construcción de base de datos
‡ La PCR múltiple en microbiología clínica. Los
cebadores y el programa de temperaturas
utilizado, es necesario tener en cuenta varias
premisas:
a) Escoger o diseñar oligonucleótidos que no
interaccionen entre sí, es decir, que no formen
oligómeros
b) Que tengan temperaturas de anillamiento similares
c) Que cada pareja amplifique una única secuencia
diana
d) Que generen ampliaciones de tamaño
suficientemente diferente como para poder ser
separados y diferenciados tras la amplificación.
PCR en tiempo real o PCR cuantitativa
(qPCR)
‡ Los procesos de amplificación y detección se
producen de manera simultánea en el mismo vial
cerrado
‡ Detección por fluorescencia se puede medir durante
la amplificación la cantidad de ADN
‡ La emisión de fluorescencia producida en la reacción
es proporcional a la cantidad de ADN formado
‡ La PCR a tiempo real pueden ser de dos tipos:
agentes intercalantes y sondas específicas marcadas
con fluorocromos.
± Técnicas basadas en fluorocromos:
‡ Permite cuantificar sólo una secuencia por reacción
‡ Ventaja de utilizar cebadores normales para su realización
‡ Es mucho más económica que la que usa sondas
específicas
± Técnicas basadas en sondas específicas :
‡ Utilizan una sonda unida a dos fluorocromos que hibrida
en la zona intermedia entre el cebador directo (forward) y
el inverso (reverse)
‡ Presenta una transferencia energética de fluorescencia
por resonancia (FRET).
‡ No se produce cuando la sonda está dañada y los dos
fluorocromos están distantes
‡ Esto permite monitorizar el cambio del patrón de
fluorescencia
 Utilización de Gel de Electroforesis
Capilar con Fluorescencia de Láser
inducido
‡ Consiste en la separación de los productos de PCR
por geles de electroforesis
‡ Son teñidas con bromuro de etidio, grabando la
imagen utilizando un digitalizador de imagen
‡ La cuantificación de los fragmentos de ADN
‡ El análisis CGE permite la detección de los diversos
transgenes amplificados
± Sus desventajas
‡ Son poco reproducibles y precisos
‡ Requieren grandes cantidades de muestra y
mucho tiempo
‡ Limitada de los geles de electroforesis impone
restricciones en el diseño de estándares
internos
‡ UV en geles de electroforesis capilar (CGE)
tiene poca sensibilidad
‡ fluorescencia por láser inducido (LIF) en CGE
incrementa dramáticamente el límite de
detección
 Micro arreglos

‡ La tecnología de micro arreglos puede

incrementar la facilidad y velocidad del
análisis de los productos de PCR.
‡ Es un sistema analítico que permite la
detección simultánea de
‡ muchas secuencias de ácidos nucleídos en
una muestra.
‡ Las sondas en el arreglo son hibridados con el
marcador fluorescente para productos de PCR
acidos nucleídos peptídicos (PNAs)
‡ Son análogos de los oligonucleicos
‡ Diferencia de ácidos nucleídos no contienen pentosa
ni grupo fosfato
‡ Con esta tecnología se puede construir micro
arreglos y poder identificar el gen consecutivo Lectin
y la región genéticamente modificada
± Ventaja :
‡ Es establecer enlaces con cadenas de ADN
‡ Los PNAs son más eficientes y forman híbridos más
estables que los oligonucleótidos,
‡ Los PNAs tiene una secuencia altamente especifica.
 Resonancia de plasmones
superficiales(SPR)
‡ Está basado en biosensores capases de desempeñar un
análisis de interacción bioespecifica (BIA) en tiempo
real
‡ Es una técnica óptica que detecta y cuantifica cambios
en el índice de refracción en una superficie del chip
sensor
‡ En el cual los ligandos son inmovilizados, permitiendo
la detección de biomoleculas (analitos)
interaccionando con el ligando
‡ Si la cadena simple de ADN es marcado con biotina, la
tecnología SPR puede monitorear fácilmente el
acoplamiento ADN-ADN en tiempo real